本发明专利技术公开嵌合结构IMC及其在黄瓜绿斑驳花叶病毒基因抗性烟草培育中的应用。针对现有技术未公开对CGMMV基因间隔区域的注释，也没有构思过从间隔区域筛选目的片段用于抗性烟草培育，本发明专利技术提供CGMMV基因间隔区域在介导抗性烟草培育中的应用。本发明专利技术构建嵌合结构IMC，由CGMMV基因间隔区域碱基片段IR4、MP基因片段MP1、CP基因片段CP1连接而成。成功用于植物干涉载体实现抗性烟草培育。本发明专利技术还提供利用这些目的片段介导转基因抗性烟草的完整技术方案。术方案。术方案。
【技术实现步骤摘要】
嵌合结构IMC及其在黄瓜绿斑驳花叶病毒抗性烟草培育中的应用
[0001]本申请是中国专利技术专利申请CN2021114824401（黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域在抗性烟草培育中的应用，申请日20211206）的分案申请。
[0002]本专利技术涉及一种植物抗性育种，特别是涉及一种由黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV基因介导的抗性烟草培育技术，属于基因工程、遗传育种领域。
技术介绍
[0003]黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus spp.)。CGMMV能够以西瓜、甜瓜、南瓜、瓠瓜等较多种葫芦科（Cucurbitaceae）植物作为其自然寄主，且是葫芦科植物最主要病毒之一。由于葫芦科是世界范围内仅次于禾本科、豆科与茄科的重要食用植物科，因而黄瓜绿斑驳花叶病毒容易引发田间连续大面积感染与农业生产的规模性损失，已被世界许多国家与地区都列入检疫对象。CGMMV也可侵染苋色藜（Chenopodium Amaranticolor）、曼陀罗（Datura stramonium）、菟丝子（Cuscuta chinensis）、本氏烟（Nicotiana benthamiana）、珊西烟（Nicotiana tabacum var Xanthi nc）等。本氏烟是黄瓜绿斑驳花叶病毒的试验寄主，以本氏烟作为研究对象，通过转基因的手段可以更快的解析该病毒的侵染机制。构建本氏烟草抗性材料在CGMMV研究中意义突出。
[0004]CGMMV是正义单链RNA病毒，基因组全长6423nt，5
′
端有60nt的非编码区，3
′
端有175nt的非编码区，中间部分有三个编码区。第一个编码区是与病毒复制相关的129KDa和186KDa蛋白，统称为复制相关蛋白。这两个蛋白具有共同的N端。129KDa复制相关蛋白包含甲基转移酶（Vmethyltransforase）与RNA解旋酶（RNA Helicase）结构域以及两者之间的间隔区域（Internal Region，IR）。186KDa复制相关蛋白通读区域对应依赖RNA的RNA聚合酶（RNA
‑
dependent RNA polymerase，RdRp）结构域。第二编码区是运动蛋白MP（Movement Protein）主要介导病毒细胞间运动。第三编码区是外壳蛋白CP（Coat Protein）主要介导病毒长距离运动。
[0005]利用病毒基因介导获得转基因植株抗性材料是植物抗性育种重要手段。在CGMMV的该类现有技术中，用以介导植物抗性的病毒基因目标片段均来自于运动蛋白MP与外壳蛋白CP。分别是：将CGMMV的外壳蛋白CP基因构建到植物表达载体，通过农杆菌转化西瓜砧木“gongdae”，获得具有抗性的转基因砧木材料（Transgenic watermelon rootstock resistant to CGMMV (cucumber green mottle mosaic virus) infection. Plant Cell Rep (2005) 24: 350
‑
356）；采用限制性酶切连接的方法将CGMMV的外壳蛋白CP基因构建到载体中，RNA沉默转基因烟草具有抗性（Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing. Plant Cell Rep (2007) 26:1283
‑
1288）；将CGMMV的运动蛋白MP基因正向重复构建到植物表达载
体，通过农杆菌转化甜瓜，获得了具有抗性的转基因甜瓜（Molecular analysis of transgenic melon plants showing virus resistance conferred by direct repeat of movement gene of Cucumber green mottle mosaic virus. Plant Cell Rep (2012) 31:1371
‑
1377）。
[0006]从已知的CGMMV基因组看，第一编码区相较于第二编码区运动蛋白MP与第三编码区外壳蛋白CP序列更长，能够为筛选具备介导植株抗性功能的目的基因片段提供更丰富的资源库。同时，在第一编码区中，位于含甲基转移酶与RNA解旋酶结构域两者之间的间隔区域（IR）尚未被现有研究注释功能，若能从中有效地筛选出能够介导植株抗性的目的基因片段，则能扩展现有研究对间隔区域功能的认识，表明其并非单纯间隔甲基转移酶与RNA解旋酶，可能有比较重要的功能。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的就是针对现有技术的不足，提供CGMMV基因间隔区域基因在抗性烟草培育中的应用。
[0008]本专利技术发现利用独立的CGMMV基因间隔区域能够构建植物干涉表达载体介导抗性烟草，并且利用CGMMV基因间隔区域与CGMMV非间隔区域片段组成嵌合结构所构建的植物干涉表达载体也能介导抗性烟草。
[0009]本专利技术首先提供如下技术方案如下：嵌合结构IMC，其特征在于：由CGMMV基因间隔区域碱基片段IR4（序列如SEQ ID NO.1所示）、MP基因片段MP1（序列如SEQ ID NO.2所示）、CP基因片段CP1（序列如SEQ ID NO.3所示）构成。
[0010]上述嵌合结构IMC是由CGMMV基因间隔区域碱基片段IR4（间隔区域193bp，如SEQ ID NO.1所示）、MP基因片段MP1（MP 142bp，如SEQ ID NO.2所示）、CP基因片段CP1（CP 128bp，如SEQ ID NO.3所示）连接组成，序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]本专利技术试验证明，嵌合结构IMC能够介导转基因烟草抗性。因而，本专利技术同时提供如下技术方案：包含上述嵌合结构IMC的载体。
[0012]上述载体包括重组质粒、植物干涉表达载体等。
[0013]上述嵌合结构IMC在CGMMV基因介导烟草抗性中的应用。
[0014]本专利技术基于试验数据，提供利用黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组间隔区域片段构建重组质粒培育抗性烟草的技术方案，具体如下：利用黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组间隔区域片段培育抗性烟草的方法，其特征在于：依如下步骤实施：首先，根据CGMMV目的片段设计PCR扩增引物对，经PCR扩增后回收纯化得到各PCR产物，所述CGMMV目的片段序列如SEQ ID NO.4所示；其次，将各PCR产物与干涉载体pHellsgate2进行重组反应，重组产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，筛选序列正确的阳性重组质粒；再次，各阳性重组质粒转化农杆菌筛选含阳性ihpRNAi的农杆菌；最后，用含阳性ihpRNAi的农杆菌转化烟草。
[0015]本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.嵌合结构IMC，其特征在于：由CGMMV间隔区域碱基片段IR4（SEQ ID NO.1）、MP基因片段MP1（SEQ ID NO.2）、CP基因片段CP1（SEQ ID NO.3）构成，序列如SEQ ID NO.4所示。2.权利要求1所述的嵌合结构IMC在CGMMV基因介导烟草抗性中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述烟草是本氏烟（Nicotiana benthamiana）。4.烟草干涉表达载体，其特征在于：包含权利要求1所述嵌合结构IMC。5.根据权利要求4所述的烟草干涉表达载体，其特征在于：是具有发夹结构的反向重复序列载体ihpRNAi。6.根据权利要求5所述的烟草干涉表达载体，其特征在于：回收纯化的所述黄瓜绿斑驳花叶病毒间隔区域基因片段PCR产物与干涉载体pH...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽锋，周建华，周厚成，古勤生，刘莉铭，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：
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