一种级联检测ctDNA的方法、探针、试剂盒及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种级联检测ctDNA的方法、探针、试剂盒及系统。所述探针包括发夹探针H1、H2、H3、H4和报告分子；并构建了一种高稳定的级联恒温无酶核酸信号扩增系统，解决单级恒温无酶核酸信号扩增系统难以检测低丰度生物标志物ctDNA的问题，而且本发明专利技术构建的级联恒温无酶CHA反应系统，在精准设计两级核酸信号扩增线路后，还在报告分子序列中引入高稳定性的锁核苷酸，极大地可提高级联系统的稳定性。同时，无需高成本酶，因不需反复升降温，反应时间短且不需依赖于体积大和价格较高的精密仪器，解决了现有ctDNA检测方法操作繁琐、耗时长和成本高的等问题。本高的等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种级联检测ctDNA的方法、探针、试剂盒及系统


[0001]本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种级联检测ctDNA的方法、探针、试剂盒及系统。

技术介绍

[0002]癌症是当前人类健康最大的威胁，现癌症发现常处于癌症高发展阶段且已经发生转移，造成癌症仍是当今死亡的主要原因。因此，“早发现、早诊断、早治疗”是当前癌症临床治疗的最佳途径和重要目标。目前，血清学中癌症标志物的检测是一种有前景、无创早期筛查的检测方法，具有简便和可重复性等优势。其中，循环肿瘤DNA(ctDNA)是由肿瘤细胞在凋亡或坏死过程中释放到血液中的基因组片段，通常由90～150个核苷酸构成，在癌症患者血清中异常表达且携带肿瘤特异性的遗传学信息，且因其在血液中的半衰期较短(一般小于2h，而大多数蛋白生物标志物的半衰期可达数周)更能反馈肿瘤的实时状态信息，被认为是目前具有应用前景的血清学中癌症标志物检测(液体活检)靶标之一。由于癌症患者血清学中肿瘤标志物ctDNA的丰度很低，因此需要匹配一种高灵敏度的ctDNA信号扩增检测方法。
[0003]目前主要基于DNA测序和逆转录聚合酶链式扩增(RT
‑
PCR)实现癌症患者血清样本中ctDNA检测。然而，DNA测序方法操作耗时长(通常需要2
‑
3周)且成本较高；RT
‑
PCR虽是目前最广泛应用的技术，但是方法操作繁琐、需要严格设计引物且依赖体积大、价格较高、反应时间长的精密循环温控仪器，极大的限制了其在基层医院的推广和现场检测。恒温核酸信号扩增系统可克服现有ctDNA检测系统的局限性。其中，相较于恒温有酶核酸信号扩增系统，恒温无酶核酸信号扩增CHA反应系统不依赖于对外界环境敏感、容易失活、稳定性较差且成本较高的酶系统，且制备过程简单。因此，亟需发展一种恒温无酶信号扩增的液体活检方法用于乳腺癌患者血清中ctDNA高灵敏、方便、现场检测。
[0004]常规级联的恒温无酶CHA反应系统(CHA，催化发夹自组装)(Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.PNAS,2013,110,5386
‑
5391)比单级恒温无酶CHA反应系统的信号扩增能力更强，更适用于检测低丰度生物标志物，但是常规级联系统的报告分子序列全部为脱氧核糖核苷酸，稳定性差，容易受生物环境中酶的降解而发生信号泄漏。
[0005]因此，本专利技术构建了一种高稳定性的级联恒温无酶CHA反应体系。通过精准设计两级核酸信号扩增线路，以及在报告分子序列中引入高稳定性的锁核苷酸，可提高级联系统的稳定性，为乳腺癌的早期诊断提供一种集“输入
‑
放大
‑
输出”为一体的智能小分子诊断工具。

技术实现思路

[0006]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种ctDNA探针组。
[0007]本专利技术第二方面的目的，在于提供上述ctDNA探针组的应用。
[0008]本专利技术第三方面的目的，在于提供一种试剂盒。
[0009]本专利技术第四方面的目的，在于提供一种检测系统。
[0010]本专利技术第五方面的目的，在于提供一种检测ctDNA的方法。
[0011]本专利技术所采取的技术方案是：
[0012]本专利技术的第一方面，提供一种ctDNA探针组；所述ctDNA探针组包括发夹序列H1、发夹序列H2、发夹序列H3、发夹序列H4；
[0013]所述发夹序列H1从5
’
端开始依次为1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*区域，其中1、2和3区域与ctDNA的1*，2*和3*区域互补；
[0014]所述发夹序列H2从5
’
端开始依次为3、4、3*、2*和4*区域，其中发夹序列H2的3和4区域序列与发夹探针H1的3*和4*区域序列互补；
[0015]所述发夹探针H3从5
’
端开始依次为9、8、5*、6*、7*、6、5和2区域，其中发夹探针H3的2、5和6区域与发夹探针H1的2*、5*和6*区域互补；
[0016]所述发夹探针H4从5
’
端开始依次为7*、5*、6*、7和6区域，其中发夹探针H4的6和7区域与发夹探针H3的6*和7*区域互补。
[0017]优选地，所述ctDNA探针组还包括报告序列组，所述报告序列组包括Reporter
‑
F和Reporter
‑
Q；
[0018]所述Reporter
‑
F序列从5
’
端开始依次为5、8*和9*区域；所述Reporter
‑
Q从5
’
端开始依次为9和8区域；所述Reporter
‑
Q与Reporter
‑
F序列的8*和9*区域互补；所述Reporter
‑
F序列的5、8*和9*区域与发夹探针H3的5*、8和9序列互补。
[0019]优选地，所述ctDNA为乳腺癌ctDNA。
[0020]优选地，所述ctDNA为PIK3CA E545K；所述PIK3CA E545K的序列为：5
’‑
CTCAGTGA TTTTAGA GAGAGGAT
‑3’
。
[0021]优选地，所述发夹探针H1的序列为：5
’‑
ATCCTCTC TCTAAAA TCACTGAG CCATGTGTAGA CTCAGTGA TTTTAGA CCTTGTCA TAGAGCAC
‑3’
；
[0022]所述发夹探针H2的序列为：5
’‑
TCACTGAG TCTACACATGG CTCAGTGA TTTTAGA CCATGTGTAGA
‑3’
；
[0023]所述发夹探针H3的序列为：5
’‑
GAAATCGG GTGTAGTC CCTTGTCA TAGAGCAC GCACCTCCTATATCG GTGCTCTA TGACAAGG TCTAAAA
‑3’
；
[0024]所述发夹探针H4的序列为：5
’‑
GCACCTCCTATATCG CCTTGTCA TAGAGCAC CGATATAGGAGGTGC GTGCTCTA
‑3’
；
[0025]所述Reporter
‑
F的序列为：5
’‑
TGACAAGG GACTACAC CCGATTTCCCAT
‑3’
；
[0026]优选地，所述Reporter
‑
F中的碱基包括锁苷酸修饰的碱基。
[0027]优选地，所述锁苷酸修饰的碱基数量为2～6个。
[0028]优选地，所述Reporter
‑
F中从5
’
起的第11、15、19、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ctDNA探针组；所述ctDNA探针组包括发夹序列H1、发夹序列H2、发夹序列H3、发夹序列H4；所述发夹序列H1从5
’
端开始依次为1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*区域，其中1、2和3区域与ctDNA的1*，2*和3*区域互补；所述发夹序列H2从5
’
端开始依次为3、4、3*、2*和4*区域，其中发夹序列H2的3和4区域序列与发夹探针H1的3*和4*区域序列互补；所述发夹探针H3从5
’
端开始依次为9、8、5*、6*、7*、6、5和2区域，其中发夹探针H3的2、5和6区域与发夹探针H1的2*、5*和6*区域互补；所述发夹探针H4从5
’
端开始依次为7*、5*、6*、7和6区域，其中发夹探针H4的6和7区域与发夹探针H3的6*和7*区域互补。2.根据权利要求1所述的ctDNA探针组，其特征在于所述ctDNA探针组还包括报告序列组，所述报告序列组包括Reporter
‑
F和Reporter
‑
Q；所述Reporter
‑
F序列从5
’
端开始依次为5、8*和9*区域；所述Reporter
‑
Q从5
’
端开始依次为9和8区域；所述Reporter
‑
Q与Reporter
‑
F序列的8*和9*区域互补；所述Reporter
‑
F序列的5、8*和9*区域与发夹探针H3的5*、8和9序列互补。3.根据权利要求1所述的ctDNA探针组，其特征在于，所述ctDNA为乳腺癌ctDNA；优选地，所述ctDNA为PIK3CA E545K；优选地，所述PIK3CA E545K的序列为：5
’‑
CTCAGTGA TTTTAGAGAGAGGAT
‑3’
。4.根据权利要求1～3任一项所述的ctDNA探针组，其特征在于，所述发夹探针H1的序列为：5
’‑
ATCCTCTC TCTAAAA TCACTGAGCCATGTGTAGA CTCAGTGA TTTTAGA CCTTGTCA TAGAGCAC
‑3’
；所述发夹探针H2的序列为：5
’‑
TCACTGAG TCTACACATGG CTCAGTGATTTTAGA CCATGTGTAGA
‑3’
；所述发夹探针H3的...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭凯月，邹丽丽，吕倩，
申请(专利权)人：广东省科学院生物与医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：