一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，所述产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株DHAV3VP1

【技术实现步骤摘要】
一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术属于兽用诊断生物制品
，涉及一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，尤其涉及一种抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体、其杂交瘤细胞株、以及包含其中一种基于单克隆抗体的鸭甲型肝炎病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒。

技术介绍

[0002]鸭III型病毒性肝炎是由鸭III型甲型肝炎病毒(duck hepatitis Avirus，DHAV)引起的一种以肝脏肿胀、出血为主要症状的急性、烈性传染病，主要侵害3周龄内雏鸭，给养鸭业带来了巨大的经济损失。鸭甲型肝炎病毒有3个血清型(I型，II型和III型)，II型和其他两种血清型间无交叉反应性。主要流行的是I型和III型鸭甲型肝炎病毒，防控III型鸭甲型肝炎病毒是目前亟待解决的问题，建立快速、灵敏、特异性高的DHAV血清学诊断方法是防控该疾病、阻断疾病快速传播和评价疫苗免疫效果的重要手段。
[0003]CN106990247A公开了一种同时检测I型和III型鸭甲型肝炎病毒的胶体金试纸条及其制备方法，该试纸条由底板、硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝酸纤维素膜上的质控线包被抗鼠IgG，检测线包被抗I型鸭甲型肝炎病毒多抗，金标垫包被胶体金标记的同时识别I型和III型鸭甲型肝炎病毒的单克隆抗体；该试纸条具有良好的灵敏度、特异性、重复性和稳定性，从而为临床和基层单位不漏检I型或III型鸭甲型肝炎病毒提供了一种广谱、灵敏、特异、简单、快速的检测技术。上述方法能同时识别I型和III型鸭甲型肝炎病毒，但是上述方法无法区分I型和III型鸭甲型肝炎病毒。
[0004]酶联免疫吸附试验是抗体检测的普遍方法，不仅快速灵敏，而且可以进行大规模检测。现有的间接ELISA方法，使用全病毒包被，存在抗原不易纯化，且抗原含量不多等缺点，间接ELISA方法也存在非特异性高、敏感性低等缺点。因此，提供一种高敏感性的鸭肝炎病毒抗体检测产品具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。由所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体具有较强的特异性和中和活性，鸭胚中和效价可达10
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3.5
。以所述单克隆抗体建立的阻断ELISA检测方法能够快速、灵敏地检测III型鸭甲型肝炎病毒，实现对III型鸭甲型肝炎病毒的临床诊断、雏鸭母源抗体及其疫苗免疫效力评估等检测。
[0006]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株DHAV3 VP1
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Mab 4B8，保藏在武汉大学保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区
八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:C202375，保藏日期为2023年4月18日。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体，所述抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体由第一方面所述的杂交瘤细胞株产生。
[0009]第三方面，本专利技术提供第一方面所述的产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株和/或第二方面所述的抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体在制备诊断、检测或治疗III型鸭甲型肝炎病毒的产品中的应用。
[0010]第四方面，本专利技术提供一种检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括第二方面所述的抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体。
[0011]优选地，所述试剂盒为阻断ELISA试剂盒。
[0012]优选地，所述试剂盒还包括：包被酶标板、阳性血清、阴性血清、包被缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、封闭液、显色液、终止液、封板膜或说明书中任意一种或至少两种的组合。
[0013]优选地，所述包被酶标板以III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒(DHAV3 VLPs)作为包被抗原。
[0014]优选地，所述III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒包括III型鸭甲型肝炎病毒VLPs P1抗原和III型鸭甲型肝炎病毒VLPs 3CD抗原。
[0015]优选地，所述III型鸭甲型肝炎病毒VLPs P1抗原中包括III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白。
[0016]优选地，所述包被抗原的使用浓度为0.8
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1.2μg/mL，例如可以是0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.1μg/mL或1.2μg/mL等。
[0017]优选地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
[0018](1)将待测血清样品与包被抗原作用后，加入抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体、酶标二抗、显色液和终止液反应；
[0019](2)采用酶标仪读取吸光度值OD
450nm
，并按公式：
[0020]阻断率(％)＝(阴性对照孔平均OD
450nm
值
‑
样品孔平均OD
450nm
值)/阴性对照孔平均OD
450nm
值
×
100％，计算待测血清样品的阻断率，判定检测结果。
[0021]优选地，所述检测结果的判定标准为：
[0022]阻断率≥38.2％时为III型鸭甲型肝炎病毒抗体阳性；阻断率≤29.2％时为III型鸭甲型肝炎病毒抗体阴性；29.2％＜阻断率＜38.2％时为可疑，需重复检测，若重复检测结果阻断率仍小于38.2％，则判定为III型鸭甲型肝炎病毒抗体阴性。
[0023]本专利技术中，采用所述试剂盒进行检测的具体步骤如下所示：
[0024](1)包被抗原：用包被缓冲液将III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒(DHAV
‑
3VLPs)稀释至0.8
‑
1.2μg/mL，向微孔中每孔加100μL，4℃过夜包被，甩掉孔内液体(尽量拍干孔里面的液体)，洗涤三次，每次5min；
[0025](2)封闭：用洗涤液PBST配制1％ BSA作为封闭液，每孔200μL，37℃孵育60min；甩掉孔内液体，逐个孔加满洗涤缓冲液200μL，静置5min，甩掉孔内液体，拍干，洗涤缓冲液洗三次；
[0026](3)孵育一抗：将待测血清稀释至1:32，向微孔中每孔加100μL，37℃，孵育60min，同样洗涤三次，每次5min，拍干；
[0027](4)加单克隆抗体：DHAV
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3VP1
‑
Mab(抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体)稀释至0.5μg/mL，向微孔中每孔加100μL，37℃，孵育60min，同样洗涤三次，每次5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株DHAV3 VP1
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Mab 4B8，保藏在武汉大学保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCCNO:C202375，保藏日期为2023年4月18日。2.一种抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体由权利要求1中所述的杂交瘤细胞株产生。3.权利要求1所述的产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株和/或权利要求2所述的抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体在制备诊断、检测或治疗III型鸭甲型肝炎病毒的产品中的应用。4.一种检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求2所述的抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为阻断ELISA试剂盒。6.根据权利要求4或5所述的检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：包被酶标板、阳性血清、阴性血清、包被缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、封闭液、显色液、终止液、封板膜或说明书中任意一种或至少两种的组合。7.根据权利要求6所述的检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述包被酶标板以III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒作为包被抗原；优选地，所述III型...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋翠萍，丁铲，廖瑛，仇旭升，谭磊，孙英杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：