细菌杀昆虫蛋白制造技术

本发明专利技术分离了细菌杀昆虫蛋白及其等价物。这些蛋白和编码所述蛋白的ＤＮＡ序列可用于制备杀昆虫组合物或转基因植物，以保护植物不受昆虫尤其是鞘翅目昆虫的损害。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
细菌杀昆虫蛋白
技术介绍
1. 专利
本专利技术涉及从细菌菌林，优选短芽孢杆菌(Brevibacillus )菌抹，最优 选侧孢短小芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus )菌抹分离的、新的杀昆虫 分泌蛋白("ISP")及编码该蛋白的DNA，当所述蛋白与ISP-支助蛋白 (ISP-complimentary protein),如本专利技术的另一种ISP蛋白组合被昆虫才l^v 后即可杀昆虫。这些蛋白可用于防止或减少田地里昆虫，特别是玉米根虫对 植物的损害。本专利技术还涉及植物，特别是玉米植物，所述植物通过在其细胞中表# 专利技术的ISP蛋白而具有杀昆虫能力，优选杀鞘翅目昆虫特别是叶甲属 (Diabrotica )、马铃薯叶甲属(Leptinotarsa )和花象属(Anthonomus ) 种的昆虫。本专利技术还涉及通过使下述的昆虫才IIX本专利技术的ISP蛋白，特别是具有 SEQ ID No. 2， 4， 8或10之任一项的^酸序列的蛋白，或其中具有杀昆虫 活性的片段来控制由叶甲属(Diabrotica )、马铃薯叶甲属(Leptinotarsa ) 或花象属(Anthonomus )种昆虫，优选叶甲属(Diabrotica )种昆虫害虫， 特别是玉米才艮虫引起的损失的方法。2. 现有纟支术的描述已发现一些最具石皮坏性的害虫属于Diabroticine beetles,在北美，人们 i人为三种重要的玉米才艮虫，玉米才艮叶曱(Diabrotica virgifera )(西部玉米 根虫)、Diabrotica barberi (北部玉米根虫)和黄瓜十一星叶曱食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)(南部玉米根虫)是需要花费最昂 贵资金来控制的病虫害。(Metcalf， 1986， Foreword ， "Methods for the Study of Pest Diabrotica" ， pp. vii-xv ， 编者 Krysan， J丄.和 Miller, T.A.， Springer國Verlag， 纽约)。玉米根叶甲(Diabrotica virgifera )和Diabrotica barberi被i人为是美国和加拿大主要生产玉米的州中最为严重的玉米病虫害 (Levine和Oloumi-Sadeghi， 1991， Annu. Rev. Entomol. 36， 229-55)。其幼虫 以玉米根为食，从而对玉米的生长和收获造成直接的损害。控制幼虫损害玉 米根系的土壤杀昆虫剂和减少曱虫损害玉米穗的空气喷雾剂的费用，加上玉 米的亏损每年有将近十亿美圆(Metcalf，1986，参见上文)。最近，在美国的一 些州发现在种植玉米后种植大豆的轮作方式失去了作用，这是由于玉米根虫 已经适应了这种情况。对玉米根虫具有毒性的细菌菌林和/或基因在美国专利6,023,013; 6，015，553;6，001，637;5，卯6，818和5，645，831中已有描述。另夕卜，PCT出版物 、VO 00/09697， WO 99/57282， WO 98/18932, WO 97/40162，和WO 00/26378 也涉及到可从芽孢杆菌(Bacillus )或其它细菌种获得的毒素和基因，其中 的一些被ial^对玉米根虫具有毒性。WO 98/44137， WO 94/21795和WO 96/10083涉及以在营养生长过程中产生的杀昆虫蛋白和辅助蛋白为特征的 杀昆虫芽孢杆菌(Bacillus )菌林，并描述了其中的一些对玉米根虫具有毒 性。美国专利5,055,293描述了一种通过向土it裏中接种形成伴胞晶体的侧孢 芽孢杆菌(Bacillus laterosporus )来控制玉米才艮虫的方法。Orlova等(1998， Applied Environmental Microbiol. 64， 2723)报道了在 有晶体形成的侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus )中与蛋白晶体相关的杀 蚊虫活性。专利技术目的M明简述本专利技术的目的在于提供对昆虫，优选叶曱属(Diabrotica )种昆虫,特别 是玉米根虫具有显著毒性的新的蛋白和编码该蛋白的DNA序列。在本专利技术的一个实施方案中，提供了包含SEQ ID No. 2中最小活性毒素蛋白的M酸序列的蛋白，其中所述最小活性毒素a) 是SEQ ID No. 2所示蛋白的片段，且b) 当与SEQ ID No. 4中51到457位^J^,列所示的蛋白组合被玉 米根叶甲(Diabrotica virgifera )幼虫才l^^能够将所述幼虫杀死。还提供了包含SEQ ID No. 4中最小活性毒素蛋白的絲,列的蛋白， 其中所述的最小活性毒素a) 是SEQ ID No. 4所示蛋白的片段，且b) 当与SEQIDNo,2中38到871位M,列所示的蛋白组合被玉米 根叶甲(Diabrotica virgifera )幼虫損Uv后能够将所述幼虫杀死。特别优选的是以包含SEQ ID No. 2中38到768或781位的^J^,列 为特征的蛋白，优选以SEQ ID No. 2或SEQ ID No.lO的^J^酸序列为特征 的蛋白；和以含有SEQ ID No. 4从第51位M酸到第449或457位綠 酸的序列为特征的蛋白，优选以SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 8的^J^崎 列为特征的蛋白。本专利技术的另 一个目的是提供一种蛋白质，其包含isplA DNA所编码蛋 白的蛋白酶消化片段的氨基酸序列，所述的isplA DNA保藏于 BCCM-LMBP，保藏号为LMBP4009，其中所述蛋白酶消化片段当与SEQ ID. No. 4中第51位到第457位M酸组成的蛋白组合施用时对玉米根叶甲(Diabrotica virgifera )具有杀昆虫作用;以及一种包含isp2A DNA所编码 蛋白的蛋白酶消化片段的M^列的蛋白，所述的isp2A DNA保藏于 BCCM-LMBP,保藏号为LMBP 4009,所述蛋白酶消化片段当与SEQ ID. No. 2中第38位到第871位M酸组成的蛋白组合施用时对玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)具有杀昆虫作用;具体地说，其中所述的蛋白酶消 化片段可经鞘翅目昆虫消化液处理得到。本专利技术还提供编码上述蛋白的DNA序列，特别是含有与天然存在的 DNA序列相比所使用的密码子不同但编码的蛋白序列相同的人工DNA序列 的DNA，该DNA优选包含在嵌合基因中可操作地与能在植物中表达的启动 子区域(即适合用于植物细胞中的表达的启动子区域，其可来源于细菌，病8毒或植物也可以是人工制备的)，尤其是优先在根组织中具有活性的启动子 区域相连接。在本专利技术的一个实施方案中，所述嵌合基因中的启动子包含SEQ ID No. 5或6的DNA序列或者可在严紧M下与其杂交的DNA。在本专利技术另 一实施方案中，所述的嵌合基因还包含用于从细胞中向外分 泌或靶向细胞器的信号肽，特别是叶绿体转运肽。本专利技术还提供如下植物细胞、植物或种子，特别是玉米细胞、植物或种 子，它们包含整合到其细胞中的上述任一嵌合基因，特别是编码ISP1A或 其本文档来自技高网...

【技术保护点】
由ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．４的氨基酸序列组成的蛋白质、或通过在所述序列中添加、缺失或置换一个或几个氨基酸而自其衍生的蛋白质、或由在严谨杂交条件下与ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３或７的ＤＮＡ序列杂交的ＤＮＡ编码的蛋白质，其中所述蛋白质或所述衍生的 蛋白质当与ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２中氨基酸位置３８至氨基酸位置８７１所示的蛋白组合被玉米根叶甲幼虫摄入后能够将所述昆虫杀死。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A伯特斯，G阿尔诺，N达默，J万瑞，
申请(专利权)人：拜尔生物科学公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]