一种酪胺生产菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种酪胺生产菌株及其构建方法与应用，所述酪胺生产菌株采用从头合成的定向改造方法获得，以葡萄糖为碳源，无需添加酪氨酸底物，生产成本低，具有生产速率高，发酵周期短，菌株稳定性高的优点，具有很高的经济效益；应用过程中，利用5L发酵罐，发酵36h时，酪胺的产量为13g/L；对发酵过程中PLP的添加量进行优化，一方面能够保证酪氨酸脱羧酶的催化需求，另一方面能够避免高浓度PLP辅因子造成的资源浪费，节约生产成本，提高生产效益，为实现酪胺的大规模生产奠定基础。酪胺的大规模生产奠定基础。酪胺的大规模生产奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种酪胺生产菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及发酵工程
，尤其是一种酪胺生产菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]酪胺(L
‑
tyrami ne)又名对羟基苯乙胺，是一种生物胺。在医药、化妆品、保健、化工等行业具有重要应用。
[0003]目前酪胺合成方法主要为化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。化学合成法存在环境污染较大，转化率较低的问题；酶催化法是由酪氨酸脱羧酶作为关键酶催化酪氨酸底物生成酪胺，此方法对环境污染少，反应条件温和，但在催化过程中需要添加酪氨酸底物，增加了生产成本；微生物发酵法是以葡萄糖作为微生物生长的能量来源，微生物从头合成酪胺，无需添加底物，减少了生产成本，发酵过程条件温和，具有工业化生产的潜力。
[0004]酪胺发酵过程中的关键酶是酪氨酸脱羧酶，其依赖磷酸吡哆醛催化酪氨酸脱羧生成酪胺并释放CO2。通常来讲辅因子PLP添加量较少时，不满足酪氨酸脱羧酶催化的要求，会造成酪胺的生成量降低；当PLP添加量较多的时候，导致部分辅因子没有起到作用，造成资源的浪费。因此为了避免这两种情况的出现，需要探究酪胺发酵过程中最适PLP添加量，为后续酪胺发酵工艺的优化做铺垫。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种酪胺生产菌株。
[0006]本专利技术所要解决的技术问题在于提供上述酪胺生产菌株的构建方法。
[0007]本专利技术所要解决的技术问题在于提供上述酪胺生产菌株的应用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
[0009]一种酪胺生产菌株，是利用代谢工程改造方法在出发菌株E.coliW3110基础上进行进一步改造获得的，具体为对tynA、tyrA
fbr
、aroG
fbr
、tyrB、tdc、tyrP基因的表达强度进行调整，其中：
[0010]在E.coli W3110基因组上敲除tynA基因，使其不表达，
[0011]在yciQ假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrA
fbr
基因过表达，
[0012]在mbhA假基因位点使用P
trc
启动子控制aroG
fbr
基因过表达，
[0013]在yeeL假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrB基因过表达，
[0014]在ygaY假基因位点使用P
trc
启动子控制tdc基因异源表达，
[0015]在yjiT假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrP基因过表达。
[0016]优选的，上述酪胺生产菌株，所述代谢工程改造方法为CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术。
[0017]优选的，上述酪胺生产菌株，所述出发菌株为E.coliW3110，保藏号为ATCC273250。
[0018]优选的，上述酪胺生产菌株，所述酪胺氧化酶基因tynA，来源于大肠杆菌，敲除该基因可有效减少酪胺的分解代谢，以达到酪胺积累的目的。
[0019]优选的，上述酪胺生产菌株，所述预苯酸脱氢酶基因tyrA
fbr
，为大肠杆菌突变后的tyrA
fbr
基因，其编码酪氨酸合成的第一个酶，突变后可解除负反馈抑制作用，该酶可有效提高酪胺前体物酪氨酸的产量。
[0020]优选的，上述酪胺生产菌株，所述DAHP合成酶基因aroG
fbr
，为大肠杆菌突变后的aroG
fbr
基因，其编码莽草酸途径的第一个酶，同时也是该途径的关键酶，突变后可解除负反馈抑制作用，其可提高酪胺前体物的产量。
[0021]优选的，上述酪胺生产菌株，所述芳香族氨基转移酶tyrB基因，来源于大肠杆菌，其编码的酶可促进酪胺的前体物质酪氨酸的积累。
[0022]优选的，上述酪胺生产菌株，所述酪氨酸脱羧酶tdc基因，来源于短乳杆菌密码子优化后的tdc基因，其编码催化酪胺生成的关键酶。
[0023]优选的，上述酪胺生产菌株，所述酪氨酸转运蛋白tyrP基因，来源于大肠杆菌，其可促进菌体吸收酪氨酸，并将胞内产物酪胺转运到胞外。
[0024]上述酪胺生产菌株的构建方法，在出发菌株E.coliW3110基础上进行进一步定向改造，具体步骤如下：
[0025](1)在出发菌株E.coli W3110基因组上敲除tynA基因得到菌株Tym01；
[0026](2)以菌株Tym01为出发菌株，在yciQ假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrA
fbr
基因过表达得到菌株Tym02；
[0027](3)以菌株Tym02为出发菌株，在mbhA假基因位点使用P
trc
启动子控制aroG
fbr
基因过表达得到菌株Tym03；
[0028](4)以菌株Tym03为出发菌株，在yeeL假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrB基因过表达得到菌株Tym04；
[0029](5)以菌株Tym04为出发菌株在ygaY假基因位点使用P
trc
启动子控制tdc基因异源表达得到菌株Tym05；
[0030](6)以菌株Tym05为出发菌株在yjiT假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrP基因过表达得到菌株Tym06，菌株Tym06即为改造成功后的目的菌。
[0031]优选的，上述酪胺生产菌株的构建方法，所述P
trc
启动子具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；所述tynA基因具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；所述tyrA
fbr
基因具有序列表SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；所述aroG
fbr
基因具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；所述tyrB基因具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；所述tdc基因具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；所述tyrP基因具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。
[0032]上述酪胺生产菌株在发酵生产酪胺方面的应用。
[0033]优选的，上述酪胺生产菌株的应用，具体步骤如下：
[0034](1)种子培养：使用5L机械搅拌式发酵罐，培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0
±
0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30％，当OD
600nm
为15时达到接种要求；
[0035](2)发酵培养：使用5L机械搅拌式发酵罐，接种量为20％，培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0
±
0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30％，通过流加80％葡萄糖溶液将罐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酪胺生产菌株，其特征在于：是利用代谢工程改造方法在出发菌株E.coliW3110基础上进行进一步改造获得的，具体为对tynA、tyrA
fbr
、aroG
fbr
、tyrB、tdc、tyrP基因的表达强度进行调整，其中：在E.coli W3110基因组上敲除tynA基因，使其不表达，在yciQ假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrA
fbr
基因过表达，在mbhA假基因位点使用P
trc
启动子控制aroG
fbr
基因过表达，在yeeL假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrB基因过表达，在ygaY假基因位点使用P
trc
启动子控制tdc基因异源表达，在yjiT假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrP基因过表达。2.根据权利要求1所述的酪胺生产菌株，其特征在于：所述代谢工程改造方法为CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术。3.根据权利要求1所述的酪胺生产菌株，其特征在于：所述出发菌株为E.coliW3110，保藏号为ATCC 273250。4.根据权利要求1所述的酪胺生产菌株，其特征在于：所述酪胺氧化酶基因tynA，来源于大肠杆菌；所述预苯酸脱氢酶基因tyrA
fbr
，为大肠杆菌突变后的tyrA
fbr
基因；所述DAHP合成酶基因aroG
fbr
，为大肠杆菌突变后的aroG
fbr
基因；所述芳香族氨基转移酶tyrB基因，来源于大肠杆菌；所述酪氨酸脱羧酶tdc基因，来源于短乳杆菌密码子优化后的tdc基因；所述酪氨酸转运蛋白tyrP基因，来源于大肠杆菌。5.权利要求1所述酪胺生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coliW3110基础上进行进一步定向改造，具体步骤如下：(1)在出发菌株E.coli W3110基因组上敲除tynA基因得到菌株Tym01；(2)以菌株Tym01为出发菌株，在yciQ假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrA
fbr
基因过表达得到菌株Tym02；(3)以菌株Tym02为出发菌株，在mbhA假基因位点使用P
trc
启动子控制aroG
fbr
基因过表达得到菌株Tym03；(4)以菌株Tym03为出发菌株，在yeeL假基因位点使用P
trc
启动子控制tyrB基因过表达得到菌株Tym04；(5)以菌株Tym04为出发菌株在ygaY假基因位点使用P
trc
启动子控制tdc基因异源表达得到菌株Tym05；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，马零，李旭，陈志超，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：