一种十肽及其提取纯化方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种十肽及其提取纯化方法和应用，属于生物活性肽领域，其氨基酸序列为RGFPGGDGAA，还公开了其制备方法以及在化妆品领域的应用。本发明专利技术公开的十肽及其提取纯化方法和应用，通过对河鲀鱼皮进行处理，提取纯化并筛选其中起到光保护作用的中心肽段，该中心肽段可用于化妆品中。肽段可用于化妆品中。肽段可用于化妆品中。

【技术实现步骤摘要】
一种十肽及其提取纯化方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物活性肽领域，特别是涉及一种十肽及其提取纯化方法和应用。

技术介绍

[0002]皮肤是人体最大的器官，是先天免疫系统的重要组成部分，是保护人体内部器官免受外界环境损伤的第一道防线。皮肤主要由真皮、表皮和皮下组织构成，此外还包含了毛发以及汗腺等皮肤附属物，其中皮肤的外观特征可以直接反映人体的衰老程度。皮肤老化分为内在老化和外在老化，也称内源性老化和外源性老化。内源性老化是指人随年龄增长而发生的生理和遗传性皮肤老化；外源性老化是指太阳光照、温度、灰尘、空气污染、化学因素以及细菌侵染等因素对皮肤的刺激而导致的皮肤老化。由UV造成的皮肤老化定义为皮肤光老化。UV包含3种射线，分别为UVA、UVB和UVC，UVA的波长范围为320
‑
400nm，UVB的波长范围为280
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320nm，UVC的波长范围为100
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280nm。UVC射线由于其波长较短，大部分都被臭氧层吸收；UVB射线部分被臭氧层吸收，部分被皮肤的表皮层吸收，还会渗透到皮肤真皮的上层，破坏皮肤真皮层胶原蛋白以及弹性蛋白的降解，与UVC和UVB相比而言，UVA的波长最长，故UVA射线会被皮肤的内部的真皮层吸收，从而对皮肤真皮层和表皮层的结构和细胞造成损伤。UV致皮肤老化的作用机制有：UV诱导皮肤氧化应激、UV对皮肤细胞外基质(ECM)的影响、UV损伤DNA、UV诱导皮肤炎症。
[0003]海洋生物特殊的生存坏境造就了有别于陆生生物的独特的新陈代谢途径和适应机制，从而产生了大量结构新颖、功能独特的活性化合物。海洋生物活性肽是其中一类重要的天然产物，具有分子量小、易于吸收和生物利用率高等特点，在海洋化妆品和功能食品领域都是极具发展前景的功能因子。海洋生物活性肽是源于海洋生物的具有调节生物体生理功能的肽类，分子量一般小于6kDa。与蛋白质相比，海洋生物活性肽具有分子量小，易消化，低毒性，生物利用率高等特点，成为了生物医药，化妆品和食品领域的研究热点。大量研究表明，海洋生物活性肽具有良好的抗光老化功效，其作用机制包括抗氧化、促进胶原合成、抑制胶原降解、抗炎、促进伤口愈合和缓解细胞凋亡。
[0004]MMPs是一类能够降解皮肤真皮层胶原蛋白且含有Zn
2+
和Ca
2+
的内肽酶，MMPs主要由成纤维细胞分泌，在皮肤真皮层胶原合成和胶原降解起到平衡的作用。UV辐射皮肤会上调MMPs表达，继而加速皮肤胶原蛋白的降解，导致胶原合成和胶原降解失衡，使皮肤出现皱纹，造成皮肤衰老。因此MMPs是导致皮肤光老化的关键酶。养殖双斑东方鲀鱼皮为无毒级别，富含胶原蛋白，是胶原蛋白及其胶原肽的理想来源。不同分子量大小的双斑东方鲀鱼皮胶原肽(TBSCH)具有抗光老化的功效，其中分子量＜1kDa的肽的光保护的效果最佳。现有河鲀鱼皮中发挥光保护作用的中心活性肽段序列仍未知。
[0005]此外，目前多肽的分离纯化技术已经成熟，包括膜分离、色谱分离和电泳法等，但这些分离纯化技术存在耗时长、成本高和损失率高等特点。虚拟筛选可从大量化合物快速筛选出苗头化合物，但长期以来一直受到假阳性率高的困扰。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种十肽及其提取纯化方法和应用，目的是得到可以发挥光保护作用的活性肽的中心肽段，得到该中心肽段的分离筛选提纯方法以及该中心肽段在行业的应用。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案：
[0008]本专利技术提供的一种十肽，其氨基酸序列为：RGFPGGDGAA。
[0009]本专利技术提供的一种以河鲀为原料的多肽提取纯化筛选方法，包括如下步骤：
[0010]S1、将河鲀鱼皮切块，对鱼皮进行杂质、内源性蛋白酶、脂质物质的去除，处理后的鱼皮进行冷冻干燥后真空保存；
[0011]S2、将经过步骤S1处理后的鱼皮加入到酸溶液中进行搅拌，离心后得到的沉淀物再次加入到酸溶液中进行搅拌离心，合并两次搅拌离心后的上清液，收集沉淀物；
[0012]S3、取步骤S2所得上清液，加入缓冲液，离心后向沉淀物中加入酸溶液进行溶解，溶解后经过透析液透析，冷冻干燥后得到酸溶性胶原蛋白；
[0013]S4、取步骤S2所得沉淀物，加入酸溶液和胃蛋白酶，酶解后离心得到上清液，向上清液中加入缓冲液，离心后向沉淀物中加入酸溶液进行溶解，溶解后经过透析液透析，冷冻干燥后得到酶溶性胶原蛋白；
[0014]S5、将步骤S3和步骤S4所得的酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白合并得到胶原蛋白；
[0015]S6、将步骤S5获得的胶原蛋白通过木瓜蛋白酶进行酶解得到胶原肽；
[0016]S7、将步骤S6得到的胶原肽经过分离纯化，获得上述的多肽。
[0017]可选地，在步骤S7中，胶原肽分离纯化的步骤包括：
[0018]S71.超滤
[0019]将步骤S6得到的胶原肽经超滤获得分子量＜1kDa的数条小分子多肽；
[0020]S72.凝胶过滤层析分离
[0021]将步骤S71得到的多肽经过滤胶过滤层析处理，洗脱得到数条纯化的小份子多肽；
[0022]S73.分子虚拟筛选
[0023]将步骤S72得到的纯化的小分子多肽进行测试，经过分子虚拟筛选获得苗头多肽；测定苗头多肽的活性，获得具有活性的目标多肽。
[0024]可选地，步骤S71中胶原肽经过陶瓷膜和超滤膜，获得小于1kDa的小分子多肽，真空冷冻干燥；
[0025]步骤S72中，将小分子多肽溶于去离子水中，配制成浓度为10～15mg/mL的多肽溶液，经0.2～0.3μm滤膜进行过滤，洗脱液用0.4～0.5μm滤膜进行过滤，并且采用超声波超声除去洗脱液内的气泡；将多肽溶液注射到凝胶过滤层析柱内，使用PBS缓冲液以1～5mL/min的流速进行洗脱，洗脱液在波长为215nm处检测，室温下收集洗脱峰溶液，将洗脱峰溶液用透析袋脱盐，并真空冷冻干燥，得到纯化的小分子多肽；
[0026]步骤S73中，将纯化的小分子多肽进行是高效液相色谱与质谱分析，筛选出可信度高的多肽与MMP
‑
1受体蛋白进行虚拟分子对接，筛选得到苗头多肽；将得到的苗头多肽进行细胞活性测试，获得具有活性的目标多肽。
[0027]可选地，步骤S73中筛选可信度
‑
10lgP＞20且氨基酸的个数＜10的苗头多肽，进行
固相合成并测定其对UVB诱导L929细胞的细胞活性的影响，筛选出具有抗光老化功效的肽段为目标多肽。
[0028]可选地，在步骤S1中，去除杂质包括如下过程：按照固液比为1:15
‑
1:25的比例将鱼皮加入到0.6
‑
1.0mol/L的NaCl溶液中搅拌后冲洗。
[0029]可选地，在步骤S1中，去除内源性蛋白酶包括如下过程：去除杂质后，按照固液比为1:35
‑
1:45的比例将鱼皮浸入到0.05
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种十肽，其特征在于，其氨基酸序列为：RGFPGGDGAA。2.一种十肽提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将河鲀鱼皮切块，对鱼皮进行杂质、内源性蛋白酶、脂质物质的去除，处理后的鱼皮进行冷冻干燥后真空保存；S2、将经过步骤S1处理后的鱼皮加入到酸溶液中进行搅拌，离心后得到的沉淀物再次加入到酸溶液中进行搅拌离心，合并两次搅拌离心后的上清液，收集沉淀物；S3、取步骤S2所得上清液，加入缓冲液，离心后向沉淀物中加入酸溶液进行溶解，溶解后经过透析液透析，冷冻干燥后得到酸溶性胶原蛋白；S4、取步骤S2所得沉淀物，加入酸溶液和胃蛋白酶，酶解后离心得到上清液，向上清液中加入缓冲液，离心后向沉淀物中加入酸溶液进行溶解，溶解后经过透析液透析，冷冻干燥后得到酶溶性胶原蛋白；S5、将步骤S3和步骤S4所得的酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白合并得到胶原蛋白；S6、将步骤S5获得的胶原蛋白通过木瓜蛋白酶进行酶解得到胶原肽；S7、将步骤S6得到的胶原肽经过分离纯化，获得如权利要求1或2所述的多肽。3.根据权利要求2所述的一种十肽提取纯化方法，其特征在于：在步骤S7中，胶原肽分离纯化的步骤包括：S71.超滤将步骤S6得到的胶原肽经超滤获得分子量＜1kDa的数条小分子多肽；S72.凝胶过滤层析分离将步骤S71得到的多肽经过滤胶过滤层析处理，洗脱得到数条纯化的小份子多肽；S73.分子虚拟筛选将步骤S72得到的纯化的小分子多肽进行测试，经过分子虚拟筛选获得苗头多肽；测定苗头多肽的活性，获得具有活性的目标多肽。4.根据权利要求3所述的一种十肽提取纯化方法，其特征在于：步骤S71中胶原肽经过陶瓷膜和超滤膜，获得小于1kDa的小分子多肽，真空冷冻干燥；步骤S72中，将小分子多肽溶于去离子水中，配制成浓度为10～15mg/mL的多肽溶液，经0.2～0.3μm滤膜进行过滤，洗脱液用0.4～0.5μm滤膜进行过滤，并且采用超声波超声除去洗脱液内的气泡；将多肽溶液注射到凝胶过滤层析柱内，使用PBS缓冲液以1～5mL/min的流速进行洗脱，洗脱液在波长为215nm处检测，室温下收集洗脱峰溶液，将洗脱峰溶液用透析袋脱盐，并真空冷冻干燥，得到纯化的小分子多肽；步骤S73中，将纯化的小分子多肽进行是高效液相色谱与质谱分析，筛选出可信度高的多肽与MMP
‑
1受体蛋白进行虚拟分子对接，筛选得到苗头多肽；将得到的苗头多肽进行细胞活性测试，获得具有活性的目标多肽。5.根据权利要求4所述的一种十肽提取纯化方法，其特征在于：步骤S73中筛选可信度
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10lgP＞20且氨基酸的个数＜10的苗头多肽，进行固相合成并测定其对UVB诱导L929细胞的细胞活性的影响，筛选出具有抗光老化功效的肽段为目标多肽。6.根据权利要求2所述的一种十肽提取纯化方法，其特征在于：
在步骤S1中：去除杂质包括如下过程：按照固液比为1:15
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1:25的比例将鱼皮加入到0.6
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈贝，刘智禹，崔路路，蔡水淋，苏永昌，乔琨，许旻，
申请(专利权)人：福建省水产研究所福建水产病害防治中心，
类型：发明
国别省市：