一种萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于植物病理及微生物技术领域，具体涉及一种萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉及其构建方法和应用。本发明专利技术成功构建获得一株萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉(Pythium ultimum)Pu

【技术实现步骤摘要】
ultimum)Pu
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Luc，其荧光表达效果极佳，同时致病力与生长速度与野生型终极腐霉无显著差异，从而有助于终极腐霉的防治。基于上述研究成果，从而完成本专利技术。
[0008]为了实现上述技术目的，本专利技术提供的技术方案如下：
[0009]本专利技术的第一个方面，提供一种萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉(Pythium ultimum)Pu
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Luc，该菌株已于2023年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.40592。
[0010]本专利技术的第二个方面，提供萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉Pu
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Luc的构建方法，所述构建方法包括：
[0011]S1、构建含有Luc基因的重组表达载体；其中，所述Luc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0012]S2、将步骤S1构建获得的重组表达载体转入野生型终极腐霉中即得。
[0013]本专利技术的第三个方面，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒至少包含上述萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉Pu
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Luc。
[0014]本专利技术的第四个方面，提供上述萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉Pu
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Luc或检测试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：
[0015](a1)病原菌与植物互作研究；
[0016](a2)病原菌防治。
[0017]本专利技术的第五个方面，提供一种终极腐霉与大豆互作过程的检测观察方法，所述方法包括：将上述终极腐霉Pu
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Luc或检测试剂盒与大豆黄化苗下胚轴接触侵染，而后喷涂D
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荧光素钾盐，观察终极腐霉侵染后大豆的病斑。
[0018]上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
[0019](1)常规的Luc基因导入终极腐霉后表达效果不佳，专利技术人对Luc密码子进行了三种方案的优化，经过筛选之后，得到一个表达效果最好的菌株，并且荧光稳定性强，本专利技术获得的菌株Pu
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Luc在无G418选择培养基下多代培养(＞5代)，菌株仍具有稳定强度的荧光，极大地便利了后续的研究；
[0020](2)Luc标记的终极腐霉能够准确的观察其在大豆下胚轴组织内的定殖情况，操作简便，并且肉眼即可以观察病斑大小，省时省力，为研究腐霉在植物中的定殖机理奠定了基础；
[0021](3)上述技术方案获得的Luc标记菌株致病力与野生型菌株无显著差异，而Luc标记菌株侵染植物后，可清晰的观察到病斑情况，优于野生型菌株，可作为终极腐霉的基因工程菌株，为终极腐霉的防治提供理论依据，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
[0022]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0023]图1为本专利技术标记荧光素酶基因的终极腐霉菌株平板发光情况；
[0024]图2为本专利技术标记荧光素酶基因的终极腐霉菌株生长速度测定结果；
[0025]图3为本专利技术标记荧光素酶基因的终极腐霉菌株致病力测定结果；
[0026]图4为本专利技术终极腐霉侵染大豆下胚轴的菌斑情况。
具体实施方式
[0027]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0028]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0029]现结合具体实例对本专利技术作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030]本专利技术的一个典型具体实施方式中，提供一种萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉(Pythium ultimum)Pu
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Luc，该菌株已于2023年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.40592。
[0031]本专利技术的又一具体实施方式中，提供萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉Pu
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Luc的构建方法，所述构建方法包括：
[0032]S1、构建含有Luc基因的重组表达载体；其中，所述Luc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本专利技术通过研究发现，常规的Luc基因导入终极腐霉后表达效果不佳，因此进行密码子优化，最终获得上述Luc基因，其在终极腐霉中不仅表达效果最佳，且具有极强的荧光稳定性。
[0033]S2、将步骤S1构建获得的重组表达载体转入野生型终极腐霉中即得。
[0034]其中，所述步骤S1中，所述重组表达载体为重组质粒，其是由上述Luc基因有效地连接到质粒载体上获得，其中，所述质粒载体为pGL3
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basic质粒。
[0035]所述步骤S2中，所述转入可采用常规方法进行，在本专利技术的一个具体实施方式中，所述转入可采用PEG介导的原生质体转化的方法。
[0036]进一步的，采用G418(Geneticin，遗传霉素)对获得的转化子进行筛选。
[0037]本专利技术的又一具体实施方式中，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒至少包含上述萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉Pu
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Luc。
[0038]所述检测试剂盒还可以包含菌剂可接受的辅料，所述辅料包括但不限于分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂。本专利技术对所述菌剂可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
[0039]本专利技术的又一具体实施方式中，提供上述萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉Pu
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Luc或检测试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：
[0040](a1)病原菌与植物互作研究；
[0041](a2)病原菌防治。
[0042]本专利技术的又一具体实施方式中，所述(a2)中，所述病原菌防治包括病原菌抑制剂和/或病害抑制剂研发。
CaCl2，0.5M KCl、灭过菌的ddH2O等)，配制酶解液和40％的PEG(现用现配，细菌过滤器过滤)。
[0057](5)用包扎有纱布的400mL烧杯收集菌丝，用镊子将菌丝放入含有0.8MMannitol的培养皿中漂洗2min，用包扎有纱布的烧杯过滤，然后将漂洗过后的菌丝移入干净的无菌离心管中加0.8M Mannit本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉(Pythium ultimum)Pu
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Luc，该菌株已于2023年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40592。2.权利要求1所述萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉Pu
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Luc的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：S1、构建含有Luc基因的重组表达载体；其中，所述Luc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；S2、将步骤S1构建获得的重组表达载体转入野生型终极腐霉中即得。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述重组表达载体为重组质粒，其是由所述Luc基因有效地连接到质粒载体上获得；进一步的，所述质粒载体为pGL3
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basic质粒。4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述转入采用PEG介导的原生质体转化的方法。5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，采用G418对获得的转化子进行筛选。6.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒至少包含权利要求1所述的萤火虫荧光素酶标记的终极腐霉Pu
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Luc。7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯慧，王杰，黄斌，王静，王新伟，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所中国烟草总公司青州烟草研究所，
类型：发明
国别省市：