重组AaLS-BSP融合肽、制备方法及应用技术

本发明专利技术于生物技术领域，公开了重组AaLS

【技术实现步骤摘要】
重组AaLS
‑
BSP融合肽、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及重组AaLS
‑
BSP融合肽、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]来源于超嗜热菌Aquifex aeolicus的Lumazine合酶(AaLS)由60个相同的亚基组成，具有球形和空心二十面体衣壳结构，能形成一种自组装蛋白质纳米颗粒(Kim et al 2022；Zha ng et al 2001)。这些组装体的颗粒性质和重复的亚基组织能够作为抗原递呈的展示平台(La montagne et al 2022)，并产生高于单体蛋白支架产生的抗体水平(LadensteinMorgunova 2020)。抗原展示在自组装纳米颗粒上可以刺激强烈的免疫反应，在一些临床研究中，超嗜热菌Aquifex aeolicus(AaLS)已被用作纳米颗粒免疫原的支架。
[0003]AaLS的N端暴露在纳米颗粒表面，因此可以用作抗原展示。AaLS的C端也可暴露在纳米颗粒表面，可用于连接或显示纯化标签(Ba Reun Kim et al 2022)。针对不同的抗原展示，需要对AaLS蛋白支架颗粒进行改造，例如Aebischer等人利用LS建立了一个持久且适应性强的自组装多聚蛋白支架颗粒(LS
‑
MPSP),将SpyTag/SpyCatcher介导的插入式显示技术应用于LS
‑
MPSP的预组装颗粒上，以展示两种模型抗原，结果表明纳米颗粒提高了免疫原性和疫苗效力(Aebischer et al 2021)。因此，本专利技术中为利用AaLS蛋白支架颗粒展示法氏囊多肽以及提高表达量，对AaLS蛋白支架进行了氨基酸突变，并在合适位置增加His标签以便于纯化。
[0004]法氏囊是独属于禽类的体液中枢免疫器官，对于T、B细胞的诱导分化和成熟具有重要作用(Cai et al 2022)。法氏囊七肽BSP(TPSGLVY)来源于法氏囊的活性肽能有效刺激T、B细胞分化和增强抗体的产生(Feng et al 2010)。张秀根等将人工合成囊素与新城疫弱毒疫苗联合应用免疫鸡，能够使血清中新城疫母源抗体维持较高水平和较长时间，对诱导产生抗体有促进作用。
[0005]由于法氏囊多肽只能从鸡的法氏囊组织中提取，制备难度大，杂蛋白含量高，难以批量纯化和应用。而化学合成的法氏囊活性肽成本高，仅适用于实验室研究，无法投入实际生产应用。因此采用基因工程的方法进行研究具有非常重大的意义。
[0006]针对上述问题，本专利技术使AaLS和法氏囊多肽BSP通过柔性连接肽Linker基因串联而成，对融合肽AaLS
‑
BSP进行表达，并通过自组装形成稳定的纳米颗粒。将纯化后的融合肽AaLS
‑
BSP作为按一定剂量添加进灭活疫苗中，增强机体对抗原产生的细胞免疫反应和体液免疫反应，提高对鸡群的保护率。进一步降低佐剂以及抗原对机体的局部炎症反应以及生长性能的影响。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供了重组AaLS
‑
BSP融合肽，所述融合肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的的另一个目的在于提供了重组AaLS
‑
BSP融合肽的微生物制备方法，方法
简单，蛋白表达量高。
[0009]本专利技术的最后一个目的在于提供了重组AaLS
‑
BSP融合肽在制备免疫增强剂中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0010]重组AaLS
‑
BSP融合肽，所述融合肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，编码融合肽的多核苷酸之一为SEQ ID NO.1所示。
[0011]重组融合肽的制备方法，包括：
[0012]1)针对重组AaLS
‑
BSP融合肽基因，设计引物F1：5
’‑
cgagcggcctggtgtatAGCAGCAG CGGGTCCGGA
‑3’
和F2：5
’‑
atacaccaggccgctcggggtCATCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAG T
‑3’
，F3：5
’‑
cgagcggcctggtgtatGGATCGGGCTCTCATCACCA
‑3’
，和F4：5
’‑
atacaccaggccg ctcggggtGCCTCCTCCTGAGCCTCCA
‑3’
，然后进行SOE
‑
PCR扩增；回收SEQ ID NO.1所示多核苷酸产物；
[0013](2)将SEQ ID NO.1所示多核苷酸和质粒载体pET28a进行酶切连接，获得的质粒命名为pET28a
‑
AaLS
‑
BSP；重组质粒pET28a
‑
AaLS
‑
BSP转化进入感受态大肠杆菌BL21(DE3)，所述的感受态大肠杆菌BL21(DE3)来自于唯地生物，货号为EC1002。
[0014]本专利技术的保护范围还包括：
[0015]重组AaLS
‑
BSP融合肽或者编码该融合肽的基因在制备免疫增强剂中的应用。
[0016]以上所述的应用中，优选的，所述的免疫增强剂的应用对象为家禽。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0018]1.申请人针对原始AaLS蛋白质，对AaLS骨架进行定点突变改造，提高BSP多肽的表达量。
[0019]2.在AaLS骨架两侧的表达位点，均插入多肽，提高骨架质粒的稳定性，同时提高多肽的表达量。
[0020]3.成功制备出表达重组AaLS
‑
BSP融合肽的大肠杆菌工程菌。
[0021]4.表达出的重组AaLS
‑
BSP融合肽能够自组装形成稳定的纳米颗粒。
[0022]5.重组AaLS
‑
BSP融合肽作为免疫增强剂添加进禽用灭活疫苗能明显促进免疫鸡只体内Ig G抗体水平升高，AaLS
‑
BSP能同时促进Th1型(IL
‑
2、IL
‑
12、干扰素
‑
γ)和Th2型(IL
‑
4)细胞因子的产生。
附图说明
[0023]图1为重组AaLS
‑
BSP融合肽的表达与纯化示意图；
[0024]其中A：泳道1：未诱导蛋白表达情况；泳道2：诱导全菌蛋白表达情况；泳道3：诱导上清中的AaLS
‑
BSP蛋白，大小约21kDa；泳道4：诱导包涵体中蛋白表达情况。
[0025]B：AaLS
‑
BSP纯化后蛋白质免疫印记结果，泳道1为AaLS
‑
BSP。
[0026本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种人工合成的重组AaLS
‑
BSP融合肽，所述融合肽为SEQ ID NO.2所示。2.编码权利要求1所述的融合肽的多核苷酸。3. 根据权利要求2所述的多核苷酸，为SEQ ID NO.1所示。4.权利要求1所述的融合肽的制备方法，包括：1）针对重组AaLS
‑
BSP融合肽基因，设计引物F1：5
’‑ꢀ
cgagcggcctggtgtatAGCAGCAGCGGGTCCGGA
‑3’
和F2：5
’‑ꢀ
atacaccaggccgctcggggtCATCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGT
‑3’
，F3：5
’‑
cgagcggcctggtgtatGGATCGGGCTCTCATCACCA
‑3’
，和F4：5
’‑ꢀ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王湘如，贾超莹，付霁阳，王泽松，李祖刚，李姗曼，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：