一种糖核苷酸类产品的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种糖核苷酸类产品的制备方法，涉及生物药物技术领域。包括如下步骤：S1：将单糖、ATP、XTP、氯化镁溶解到水中，调节溶液pH值，再加入酶相应的激酶、合成酶、辅助酶进行反应，得到产物液1，所述XTP为UTP、GTP或CTP；S2：向产物液1中加入碱性磷酸酶，进行反应，得到产物液2，经微孔滤膜过滤后，采用蛋白膜包超滤除去蛋白残留，得到产物液3；S3：将产物液3通过C18层析柱进行纯化，得到产物液4；S4：将产物液4经过旋蒸浓缩后，通过离子色谱填料层析柱进行纯化，得到产物液5；S5：将产物液5采用卷式膜分离系统进行除盐处理，最后浓缩冻干，得到糖核苷酸类固体产品。本发明专利技术产品收率高，生产成本低，操作简便，产品纯度可达98％以上。产品纯度可达98％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种糖核苷酸类产品的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物药物
，具体涉及一种糖核苷酸类产品的制备方法。

技术介绍

[0002]糖是细胞生命活动所必需的三种生物大分子之一。糖在生命活动过程中发挥着极为重要的作用，是生命活动的能量来源，也是生物体的结构组分。糖能够以游离糖链及与非糖物质，如蛋白质、脂质等形成糖缀合物等形式存在，在正常生命活动如细胞间相互作用、炎症反应、信号转导、受精和发育等诸多过程中发挥着关键作用；此外，糖及糖缀合物也参与了重大疾病的发生发展过程。从糖科学的新视角探索糖链在疾病发生、发展和转移过程中的功能及分子机制是科学研究的热点。化学结构明确糖类化合物的高效获得是制约整个糖科学发展的瓶颈之一。糖基转移酶催化的寡糖合成具有效率高、选择性好、无需对糖底物进行保护等优点，是糖类化合物合成的重要手段之一，但其合成所必需的糖核苷酸供体难于制备和价格昂贵，在一定程度上限制了其在寡糖合成中的应用。
[0003]糖核苷酸(sugar nucleotide)在结构上是单糖的还原端与核苷二磷酸或者核苷一磷酸的末端磷酸基团连接而成的化合物，是单糖的活化形式。糖核苷酸是Leloir型糖基转移酶催化寡糖合成所必需的供体底物，是体外复杂寡糖的酶法合成过程的必需供体底物，在研究糖基转移酶的底物识别及其它生化性质方面具有非常重要的作用；糖核苷酸的类似物及衍生物在特异性配体靶向递送及新药研发方面也有广阔应用前景。
[0004]以往的文献和专利已公开可通过生物酶催化合成法，合成糖核苷酸及其衍生物，但在纯化方法多依赖于分子筛层析、离子沉淀、离子树脂层析等纯化手段，收率较低、成本较高，批次产量低，不利用工业化放大，严重阻碍了复杂寡糖的酶法合成及糖基转移酶催化反应机理等方面的研究工作。
[0005]因此，提供一种产品收率高，生产成本低，操作简便，纯化高且便于实现工业化放大生产的糖核苷酸类产品的制备方法，是本专利技术亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供的一种糖核苷酸类产品的制备方法，具有产品收率高，生产成本低，操作简便，便于实现工业化放大的优点，且能够使产品纯度达到98％以上；该方法不仅适用于天然糖核苷酸的合成、分离纯化、制备，同时也适用于非天然修饰的糖核苷酸的大量制备。
[0007]为了实现上述技术目的，本专利技术主要采用如下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种糖核苷酸类产品的制备方法，包括如下步骤：
[0009]S1：将单糖、ATP、XTP、氯化镁溶解到水中，调节溶液pH值，再加入相应的激酶、合成酶、辅助酶进行反应，得到XDP
‑
糖产物液1，所述XTP为UTP、GTP或CTP，XDP为UDP、GDP或CDP等；
[0010]S2：向XDP
‑
糖产物液1中加入碱性磷酸酶，进行反应，得到XDP
‑
糖产物液2，所述XDP
‑
糖产物液2经微孔滤膜过滤后，采用蛋白膜包超滤除去XDP
‑
糖产物液2中的蛋白残留，
得到XDP
‑
糖产物液3；
[0011]S3：将XDP
‑
糖产物液3通过C18层析柱进行纯化，并使用纯水洗脱产品，得到XDP
‑
糖产物液4；
[0012]S4：将XDP
‑
糖产物液4经过旋蒸浓缩后，通过离子色谱填料层析柱进行纯化，并使用配制好的流动相进行梯度洗脱；得到XDP
‑
糖产物液5；
[0013]S5：将XDP
‑
糖产物液5采用卷式膜分离系统进行除盐处理，最后浓缩冻干，即得到糖核苷酸类固体产品。
[0014]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S1和步骤S2中，反应过程通过TLC监测反应终点。
[0015]进一步的，利用TLC监测反应终点时，采用的展开剂为体积比5:4:1的异丙醇、氨水和水，染色剂为茴香醛溶液。
[0016]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S1中，所述溶液pH值为8
±
0.5。
[0017]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S2中，采用0.45μm微孔滤膜过滤所述XDP
‑
糖产物液2。
[0018]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S3中，所述C18层析柱为NMSil 50
‑
100C18。
[0019]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S4中，流动相包括A相和B相，所述A相为：10mM NaOH，pH9.5
±
0.1；B相为：10mM NaOH+0.5M NaCl，pH9.5
±
0.1。
[0020]进一步的，步骤S4中，流动相梯度洗脱程序为：
[0021]时间min流量mL/minA％B％016810004016890107016880201401685050
[0022]或，
[0023]时间min流量mL/minA％B％016810004016888128016880201401685050。
[0024]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S4中，所述离子色谱填料层析柱的为阴离子色谱制备柱。
[0025]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S5中，所述卷式膜分离系统进行除盐时的工艺参数为：室温，水洗至滤液电导率低于100μS/cm。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0027]本专利技术的糖核苷酸在制备过程中通过使用碱性磷酸酶(包括液体酶或固定化酶)可以降解反应副产物，降低产品分离难度，提高后续产品的纯化效率；其中，碱性磷酸酶作用原理是将反应体系中的主要副产物ADP(二磷酸腺苷)脱磷酸形成A(腺苷)，从而降低后续纯化的难度，其作用机理为：
[0028][0029]本专利技术采用C18制备柱和离子色谱制备柱联合使用，这些纯化方式均可机械化操作，在提高产品质量的同时，提高了工作效率和工作产能，保证糖核苷酸类产品工业化高效地生产，产品批量上能够能够达到单次公斤级输出，产品质量上保证产品纯度达到98％以上。
[0030]本专利技术对于高纯度糖核苷酸类产品，如UDP
‑
GalNAc、UDP
‑
GlcNAc、GDP
‑
Fuc、UDP
‑
GalNAz、GDP
‑
Fuc
‑6‑
N3等多种糖核苷酸的制备有较高的参考价值，适于推广应用。
附图说明
[0031]图1为本专利技术实施例1生产制备的UDP
‑
Gal产品的HPLC检测图谱；
[0032]图2为本专利技术实施例1生产制备的UDP
‑
Gal产品的MS检测图谱；
[0033]图3为本专利技术实施例生产制备的UDP
‑
Gal产品的HNMR检测图谱；
[0034]图4为本专利技术实施例2生产制备的UDP
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖核苷酸类产品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将单糖、ATP、XTP、氯化镁溶解到水中，调节溶液pH值，再加入相应的激酶、合成酶、辅助酶进行反应，得到XDP
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糖产物液1，所述XTP为UTP、GTP或CTP，XDP为UDP、GDP或CDP等；S2：向XDP
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糖产物液1中加入碱性磷酸酶，进行反应，得到XDP
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糖产物液2，所述XDP
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糖产物液2经微孔滤膜过滤后，采用蛋白膜包超滤除去XDP
‑
糖产物液2中的蛋白残留，得到XDP
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糖产物液3；S3：将XDP
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糖产物液3通过C18层析柱进行纯化，并使用纯水洗脱产品，得到XDP
‑
糖产物液4；S4：将XDP
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糖产物液4经过旋蒸浓缩后，通过离子色谱填料层析柱进行纯化，并使用配制好的流动相进行梯度洗脱；得到XDP
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糖产物液5；S5：将XDP
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糖产物液5采用卷式膜分离系统进行除盐处理，最后浓缩冻干，即得到糖核苷酸类固体产品。2.根据权利要求1所述的糖核苷酸类产品的制备方法，其特征在于，步骤S1和步骤S2中，反应过程通过TLC监测反应终点。3.根据权利要求2所述的糖核苷酸类产品的制备方法，其特征在于，利用TLC监测反应终点时，采用的展开剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁冯玲，邓俊云，刘全，肖聪，
申请(专利权)人：武汉糖智药业有限公司，
类型：发明
国别省市：