纯化T细胞的方法及其用途技术

本发明专利技术涉及纯化T细胞的方法及其用途，具体提供一种纯化CD3+T细胞的方法，其特征在于，包括步骤：(1)在DPBS中孵育标记的抗CD3抗体和PBMC，所述PBMC中的CD3

【技术实现步骤摘要】
纯化T细胞的方法及其用途


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及纯化T细胞的方法及其用途。

技术介绍

[0002]过去二十年来，癌症治疗中的免疫细胞疗法有飞跃性的发展。免疫细胞疗法使用患者自身或供者的免疫细胞，在体外经培养扩增或基因修饰后回输到患者体内，以清除或控制癌症细胞。CAR
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T细胞属于免疫细胞疗法的一种，患者或供者的T细胞经体外活化及基因工程修饰，能在T细胞上表达癌变细胞相关的抗原识别分子片段，并在胞内连接有T细胞受体活化分子及共刺激信号分子等，在与癌变细胞抗原结合后，传递下游信号，使CAR
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T细胞执行杀伤癌变细胞的功能。
[0003]目前全世界已有七款CAR
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T细胞产品通过监管机构审查并上市。CAR
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T细胞从实验室走出至产业化阶段，其生产工艺经过许多改良，主要的操作步骤包含以下数个工序：患者或供者机采血采集、自单采血中分离PBMC、自PBMC中分离及活化T细胞、CAR基因修饰T细胞、CAR
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T细胞扩增、CAR
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T细胞灌装及冻存。T细胞为CAR
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T细胞生产的基础材料，因此需从PBMC中分离出T细胞，去除不需要的细胞族群，如CD19
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B细胞及CD14
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单核细胞。由于CD3为T细胞表面的重要抗原标志，且B细胞及单核细胞的细胞膜上皆不表达CD3，所以T细胞的分离主要利用共价偶联抗
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CD3和抗
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CD28抗体的磁珠与PBMC共同孵育后，磁性分离与磁珠结合的T细胞。磁珠分选方式固然可以去除大部分悬浮的CD3阴性细胞，但由于单核细胞在体外培养时具有贴附在培养容器表面的特性，因此在磁性分选后，仍有部分单核细胞残留在培养容器中，根据过去文献发表及本公司研发经验，这部分单核细胞还可能吞噬磁珠，影响T细胞的活化。因此，在磁珠分选过程中，如何排除单核细胞的影响是需要研究的课题。
[0004]此外，上述CAR
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T生产的操作工序固然可以在生物安全柜的开放环境中以培养板及培养瓶作为培养容器，并以移液管及离心管完成操作，但根据2019年11月国家药品监督管理局食品药品审核查验中心发布的《GMP附录
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细胞治疗产品》(征求意见稿)中第十三条【密闭系统】中：“宜采用密闭设备、管路进行细胞治疗产品的生产操作；密闭设备、管路安置环境的洁净度级别可适当降低”，因此，CAR
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T细胞的生产在封闭系统中进行较为符合GMP原则的指导，也是目前同行业中大多数采取的方式。
[0005]但是，用于制备CAR
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T细胞的T细胞在处理过程中需要根据CD3
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T细胞阳性比例使用不同的方法和试剂，导致整个制备过程难以实现高封闭性。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过优化T细胞的纯化过程，实现以封闭工艺高效纯化CD3
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T细胞，降低单核细胞对CAR
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T细胞制备的不良影响。
[0007]本专利技术第一方面提供一种纯化CD3
+
T细胞的方法，包括步骤：
[0008](1)在DPBS中孵育标记的抗CD3抗体和PBMC，和
[0009](2)通过所述标记分离PBMC中的CD3
+
T细胞，
[0010]其中，所述方法不包括根据PBMC中的CD3
+
T细胞比例选择孵育缓冲液、调整细胞密度和孵育时间的步骤。
[0011]在一个或多个实施方案中，所述PBMC中的CD3
+
T细胞比例小于30％。
[0012]在一个或多个实施方案中，所述标记为便于将抗体和含表面抗原的细胞的复合物与体系中的其他组分分离的物质。
[0013]在一个或多个实施方案中，孵育混合物中还含有标记的抗CD28抗体。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体和/或抗CD28抗体与所述标记偶联。
[0014]在一个或多个实施方案中，所述标记包括但不限于生物素、固相载体。在一些优选的实施方案中，所述固相载体为磁颗粒。
[0015]在一个或多个实施方案中，所述DPBS中CD3
+
T细胞密度为4
‑
10*106个细胞/mL，优选为4
‑
7*106个细胞/mL或7
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10*106个细胞/mL。
[0016]在一个或多个实施方案中，所述孵育为摇动孵育，所述摇动为20
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500rpm，优选50
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100rpm。在一些实施方案中，所述孵育的温度为10
‑
40℃。在一些实施方案中，所述孵育时间为20
‑
60分钟，优选30
‑
45分钟。
[0017]在一个或多个实施方案中，所述方法具体包括步骤：
[0018](a)DPBS中重悬PBMC，其中CD3
+
T细胞密度为4
‑
10*106个细胞/mL，优选为4
‑
7*106个细胞/mL或7
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10*106个细胞/mL；
[0019](b)加入等体积的偶联抗CD3抗体的磁颗粒，摇动孵育20
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60分钟；
[0020](c)通过磁性捕获分离结合有CD3
+
T细胞的磁颗粒；
[0021](d)将磁颗粒与细胞分离，获得CD3
+
T细胞，
[0022]并且，所述方法不包括获取PBMC中的CD3
+
T细胞比例的步骤。
[0023]在一个或多个实施方案中，所述方法还包括活化CD3
+
T细胞的步骤，例如使用含IL
‑
2的培养基孵育CD3
+
T细胞至少24小时，优选48小时。
[0024]在一个或多个实施方案中，所述方法在纯化CD3
+
T细胞前，还包括获取PBMC的步骤。
[0025]本专利技术还提供一种使用Sepax C
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Pro细胞处理系统纯化CD3+T细胞的方法，包括步骤：(I)使用Sepax C
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Pro细胞处理系统对血液样品进行PBMC分离和冻存，去除样品中残留的红细胞及白细胞中的多核细胞，(II)使用Sepax C
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Pro细胞处理系统对冻存的PBMC进行洗涤和复苏，恢复PBMC的活率及功能性，去除死细胞，(III)使用Sepax C
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Pro细胞处理系统对复苏的PBMC进行CD3+T分选和活化，包括使用本专利技术第一方面任一实施方案所述的方法。
[0026]优选地，所述方法包括步骤：
[0027](I)使用血细胞分离机采集血浆20mL～200mL，置于2～8℃冷藏，
[0028]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从PBMC纯化CD3
+
T细胞的方法，其特征在于，包括步骤：(1)在DPBS中孵育标记的抗CD3抗体和PBMC，和(2)通过所述标记分离PBMC中的CD3
+
T细胞，其中，所述方法不包括根据PBMC中的CD3
+
T细胞比例选择孵育缓冲液、调整细胞密度和孵育时间的步骤，优选地，所述方法在纯化CD3+T细胞前还包括获取PBMC的步骤。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记为便于将抗体和表面抗原的细胞的复合物与体系中的其他组分分离的物质，优选地，所述DPBS中还含有标记的抗CD28抗体，优选地，所述抗CD3抗体和/或抗CD28抗体与所述标记偶联。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记包括生物素或固相载体；优选地，所述固相载体为磁颗粒。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBMC中的CD3
+
T细胞比例小于30％，优选地，所述DPBS中CD3
+
T细胞密度为4
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10*106个细胞/mL。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育为摇动孵育，其中所述摇动为20
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500rpm，优选50
‑
100rpm，和/或所述孵育温度为10
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40℃，和/或所述孵育时间为20
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60分钟，优选30
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45分钟。6.如权利要求1
‑
5中任一种所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(a)DPBS中重悬PBMC，其中CD3
+
T细胞密度为4
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10*106个细胞/mL；(b)加入等体积的偶联抗CD3抗体的磁颗粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海鹰，曹士婷，顾明园，胡红明，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：