一种具有表皮细胞活化功能的重组三元融合蛋白敷料的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种具有表皮细胞活化功能的重组三元融合蛋白敷料的制备方法。该敷料是基于国际同行以及本实验室对COL3A1和IFN

【技术实现步骤摘要】
一种具有表皮细胞活化功能的重组三元融合蛋白敷料的制备方法
所属
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[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及到分子克隆，蛋白质表达纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
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PAGE)和细菌侵染等技术。

技术介绍
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[0002]皮肤组织是人类身体表面的屏障，具有保护皮肤内的各种器官，阻止人体的水分和电解质等物质的丢失，保护人体不受病毒和细菌等病原物的侵染等多种作用，所以皮肤的完整性对人体的健康非常重要。但是，作为身体和外界环境直接接触的器官，皮肤不断要经受外界环境的刺激，还要接受来源于体内的各种信号，这些因素的紊乱会造成皮肤的各种疾病。皮肤类的疾病是困扰人类的重大疾病之一。除了皮肤癌等恶性的疾病，各种自身免疫失调造成的皮肤病，如湿疹、牛皮藓、红斑狼疮等，也是长期困扰人类的疾病，非常难以治愈。另外，随着年龄的增大，皮肤的老化也是困扰人类的问题，特别在当前人类的整体生活水平提高后，人类的寿命越来越长，对外貌形象的关注度也越来越高，所以对皮肤的保养和修复也越来越得到人们的重视。另外，大量良莠不齐的化妆品的使用，也对脸部皮肤造成了很大的伤害，造成很多脸部皮肤变薄，容易过敏等问题。针对这些问题，目前在市场上出现了很多种所谓的对皮肤有修复和活化作用的医疗美容类产品，根据我们的了解，这些产品从宣称的活性成分上，主要分成三大类：
[0003](1)表皮生长因子类：包括EGF(表皮生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、PDGF(血小板源性生长因子)等。这些产品使用后(在保持蛋白活性的前提下)可以促进表皮细胞的生长和代谢，对表皮的修复有一定作用。但是，作为生长因子，往往会有副作用和潜在的风险，如细胞过度的生长，在局部造成疤痕，甚至癌化。所以，正规的皮肤修复美容类产品都会建议谨慎使用。当然，由于蛋白类的产品很难在液体(包括凝胶)里保存，目前很多宣称的生长因子类产品里实际上不可能有活性的生长因子类蛋白存在。
[0004](2)透明质酸类：透明质酸又叫玻尿酸，是一种细胞外多糖，具有良好的吸水和持水作用，所以被用来作为皮肤的保水类美容填充剂。透明质酸常被用来注射于皮下，达到填充的效果，但这种效果很难持久。随着透明质酸被代谢分解，原先填充的皮肤会快速恢复原貌。如果只是外部涂抹，则很难被吸收，只是暂时起作用。美容行业上对透明质酸的宣传往往进行夸大。
[0005](3)胶原蛋白类：胶原蛋白是人体皮肤细胞外基质的主要成分之一，对皮肤的结构维持具有重要作用。胶原蛋白的主要成分为甘氨酸
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脯氨酸
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羟脯氨酸三种氨基酸的重复单元形成的三股螺旋束，结构上非常稳定，不易降解。随着年龄的增长，表皮细胞所分泌的胶原蛋白会减少，原先所存在的胶原蛋白也会随着时间的推移而降解损耗，所以会出现胶原蛋白流失，皮肤松弛的情况。针对这一问题，许多产品提出了胶原蛋白的补充方案。
[0006]针对这些问题，我们思考是否能够找到在皮肤原位通过加强胶原蛋白作用，改善皮肤的方法。一方面通过外源补充胶原蛋白，促进表皮细胞吸收；另一方面，我们还可以通
过适度活化表皮细胞，促进表皮细胞对胶原蛋白的分泌能力。通过这两个方案同时作用，希望能够达到促进局部表皮细胞再生，提高局部胶原蛋白浓度，从而改善皮肤的效果。
[0007]皮肤的胶原蛋白分子量很大，直接的涂抹很难被皮肤吸收。而且，纯化好的胶原蛋白在体外环境下，很不稳定，容易降解变质。另外，随着年龄的增长，表皮细胞的活力也会慢慢降低，对胶原蛋白的合成和分泌能力都会缓慢下降。如何适度的活化这些表皮细胞，促进局部胶原蛋白的分泌是一个难题。虽然生长因子类蛋白(如EGF，PDGF等)的使用可以活化这些细胞，但是，这种活化不好控制，大量和长期的使用很容易诱发癌症的发生。我们前期曾尝试过一个蛋白，干扰素kappa(IFN
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κ)。IFN
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κ可以有效激活局部的上皮细胞抗病毒免疫信号通路，抑制和杀灭多种病毒。对比于干扰素alpha或beta，IFN
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κ限定在上皮细胞表达，通过自分泌途径激活，所以只在上皮细胞局部起作用，外敷时不进入血液循环，不会引起全身性反应，从而避免IFN alpha和beta长期使用时的副作用；另外，近期的研究发现，IFN
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κ与HPV感染紧密相关，HPV感染抑制IFN
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κ的表达，而外源表达的IFN
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κ可以抑制HPV的激活，这些特征是IFN alpha/beta没有的。前期我们发现，IFN
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κ在外敷使用时非常安全，因为这种活化是激活人体本来就存在的先天免疫途径，只在一定的空间和时间内发生，不会有癌化风险。由于天然的免疫激活可以活化表皮细胞，促进细胞的合成和分泌，所以我们认为IFN
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κ的局部使用可以适度的活化表皮细胞，促进原位的胶原蛋白表达和分泌；同时，局部细胞的适度活化也可以促进受损伤的表皮细胞再生，促进皮肤的修复。
[0008]胶原蛋白家族共有28个成员，其中的胶原蛋白3(COL3A1)是表皮细胞丰度最高的胶原蛋白，对表皮细胞的状态维持起重要作用。全长的COL3A1很难表达，在体外也很不稳定。所以，我们通过对COL3A1的序列分析，选取其中最重要的一个区段，即VWFC结构域，以及在此结构域后边的约40个氨基酸的三螺旋束区域进行表达。VWFC结构域是COL3A1与表皮转化因子TGF
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β等相互作用的区域，而后边紧跟的三螺旋束可以大大增加VWFC的稳定性。另外，这段序列含有多个半胱氨酸，可以与三螺旋束一起，在细胞表面形成网络状保护结构。
[0009]MBP是蛋白进行表达时常用的标签蛋白，可以辅助蛋白纯化，并增加融合蛋白的稳定性，且MBP可以结合部分糖基，所以可以增加对表皮细胞的亲和力。
[0010]按照这些设想，我们对三个可能具有皮肤胶原蛋白有活化和修复功能的三个蛋白，MBP、IFN
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κ和COL3A1进行融合表达，观察它们对表皮细胞胶原蛋白的保持和活化能力。

技术实现思路
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[0011]本专利技术公开了一种具有表皮细胞活化功能的重组三元融合蛋白敷料的制备方法。其特征在于我们参照国际同行对COL3A1和IFN
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κ的功能的研究以及本实验室在大肠杆菌表达系统中对COL3A1和IFN
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κ蛋白性质的研究，通过柔性linker将COL3A1的VWFC结构域和IFN
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κ共价连接并在融合基因的一端添加6
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His
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tag，然后将其构建到含有MBP标签的载体上并进行表达，获得了溶解性和稳定性均较好的MBP
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IFN
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κ
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COL3A1融合蛋白。具体为用GGSGG通过重叠延伸聚合酶链式反应(overlap extension PCR)技术将COL3A1蛋白的VWFC结构域和IFN
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κ共价连接起来。运用over本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有表皮细胞活化功能的重组三元融合蛋白敷料的制备方法。其特征在于针对胶原蛋白流失，皮肤松弛老化等问题，并且基于蛋白的性质设计了带有MBP标签的融合蛋白MBP
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IFN
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κ
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COL3A1，该融合蛋白均一性好，易于纯化，活性高，无副作用，非常适合作为活化表皮细胞的敷料。2.根据权利要求1所述的具有表皮细胞活化功能的重组三元融合蛋白敷料设计，其特征在于使用COL3A1和IFN
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κ两种活性蛋白。3.根据权利要求1所述的具有表皮细胞活化功能的重组三元融合蛋白敷料设计，其特征在于融合蛋白中IFN
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κ在前COL3A1在后的设计顺序。4.根据权利要求1所述的具有表皮细胞活化功能的重组三元融合蛋白敷料设计，其特征在于连接IFN
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κ和COL...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘新奇，陈春生，张盼，吴坤钟，刘瑞华，
申请(专利权)人：陈春生，
类型：发明
国别省市：