一种重组工程菌及其在2,5-呋喃二甲醇合成中的应用和方法技术

本发明专利技术涉及生物基材料技术领域，具体涉及一种重组工程菌及其在2,5

【技术实现步骤摘要】
一种重组工程菌及其在2,5
‑
呋喃二甲醇合成中的应用和方法


[0001]本专利技术涉及生物基材料
，具体涉及一种重组工程菌及其在2,5
‑
呋喃二甲醇合成中的应用和方法。

技术介绍

[0002]5‑
羟甲基糠醛(5
‑
hydroxymethylfurfural,HMF)可以通过己糖脱水得到，是重要生物基平台化合物，通过化学反应可转化为各种高附加值的化学品，例如2,5
‑
呋喃二甲酸(2,5
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furandicarboxylic acid,FDCA)及FDMOL。FDMOL是一种双功能化的对称二醇，不仅在生物基塑料如聚酯、聚氨酯等具有广阔的应用前景，而且是合成精细化学品和燃料添加剂的重要中间体(ACS Catal.2018,8,2959)。
[0003]当前，化学法仍是合成FDMOL的主流方法。Hao等研究了在乙醇中ZrO(OH)2催化还原HMF，在150℃下反应2h，FDMOL产率达88％，并伴随有一定副产物的形成(Green Chem.2016,18,1080)。Thananatthanachon等在40℃下，使用Cp*Ir(TsDPEN)在THF中催化还原HMF，FDMOL产率达到99％；但是该催化剂的催化活性在数分钟内就降低了一半，其原因是该催化剂对反应的氢供体甲酸的耐受性欠佳(Angew.Chem.2010,122,6766)。Alamillo等将贵金属Ru负载到CeOx载体上，以水和正丁醇为溶剂，在130℃、27bar氢压下反应2h，FDMOL的产率为81％(Green Chem.2012,14,1413)。Aellig等以Cu/AlOx为催化剂，在220℃下反应6h，FDMOL产率达到了93％(Catal.Sci.Technol.2014,4,2326)。Zhu等研究了Cu
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ZnO在100℃条件下催化氢化HMF，FDMOL产率达99％(Catal.Sci.Technol.2015,5,4208)。虽然化学催化合成FDMOL已获得了重大的进展，但仍存在反应条件苛刻(高温、高压等)、催化剂失活严重、安全隐患、使用环境不友好的金属催化剂等诸多问题。
[0004]近年来，高效、高选择性、能耗低且环境友好的生物催化逐渐受到了关注。Li等筛选得到一株季也蒙毕赤酵母SC1103，该菌可在12h内将100mM HMF选择性还原为FDMOL，产率为86％(ChemSusChem 2017,10,372)。He等利用E.coli CCZU
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K14细胞催化200mM的HMF转化为FDMOL，72h后产率可以达到91％(Bioresour Technol.2018,247,1215)。Chen等报道了Aureobasidium subglaciale F134催化还原HMF，当底物浓度为180mM时，产率约为82％(Mol.Catal.2021,500,111341)。Xia等筛选到了一株Bacillus subtilis HA70，该菌能催化350mM HMF转化为FDMOL，产率为91％(Mol.Catal.2023,542,113122)。尽管生物催化合成FDMOL前景光明，但仍存在生物催化剂能耐受的底物浓度仍较低、合成效率不高等问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于针对现有技术的不足，而提供一种共表达醇脱氢酶RbADH和葡萄糖脱氢酶的重组工程菌E.coli
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RbADH
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GDH。
[0006]本专利技术的目的之二在于针对现有技术的不足，而提供一种重组工程菌E.coli
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RbADH
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GDH在2,5
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呋喃二甲醇合成中的应用，并建立了一种耐受底物浓度高、合成效率高、生产条件温和的全细胞催化还原HMF合成FDMOL的方法。
[0007]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：提供一种重组工程菌，该重组工程菌由以下方法构建而成：S1、利用分子探针技术通过数据库BLAST检索获得的来源于Rhodocyclaceae bacterium的醇脱氢酶RbADH，其氨基酸序列如SEQ ID.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID.2所示；S2、根据所述醇脱氢酶RbADH的氨基酸序列合成醇脱氢酶基因，以该醇脱氢酶基因为模板，通过设计特异性引物扩增该醇脱氢酶基因；S3、将扩增得到的醇脱氢酶基因插入含有葡萄糖脱氢酶基因的质粒pETDuet
‑1‑
GDH中，得到重组质粒；S4、将经测序验证的重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到醇脱氢酶RbADH和葡萄糖脱氢酶的重组工程菌E.coli
‑
RbADH
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GDH。
[0008]上述技术方案中，所述葡萄糖脱氢酶来源于Bacillus megaterium IWG3，且是突变体Q252L。
[0009]本专利技术还提供上述一种重组工程菌在2,5
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呋喃二甲醇合成中的应用。
[0010]本专利技术还提供上述一种重组工程菌用于合成2,5
‑
呋喃二甲醇的方法，包括如下步骤：(1)将所述重组工程菌接种至含有100μg/mL氨苄青霉素钠的Luria
‑
Bertani液体培养基中，在37℃、180r/min下过夜培养；(2)按1～5％的接种量将上述菌悬液转种到含有100μg/mL氨苄青霉素钠的Luria
‑
Bertani液体培养基中，于37℃、180r/min下培养，当菌液的OD
600
达到0.6～0.8时，加入0.2mM的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷，置于15～25℃、150～170r/min下诱导培养20h，培养结束后收集菌体细胞；(3)将上述收集的菌体细胞、5
‑
羟甲基糠醛、葡萄糖和弱碱加入磷酸盐缓冲液中，在一定条件下反应得到2,5
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呋喃二甲醇。
[0011]上述技术方案中，步骤(3)中，所述反应条件为反应温度20～40℃，搅拌速度120～180r/min，反应时间5～32h。
[0012]上述技术方案中，步骤(3)中，所述5
‑
羟甲基糠醛的浓度为20～800mM。
[0013]上述技术方案中，步骤(3)中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6～8；所述菌体细胞浓度为10～150mg/mL；所述葡萄糖的摩尔浓度为5
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羟甲基糠醛摩尔浓度的1.5～2.5倍；所述弱碱的摩尔浓度为5
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羟甲基糠醛摩尔浓度的1～2倍。
[0014]上述技术方案中，所述弱碱为碳酸氢钠或碳酸钙。
[0015]本专利技术利用探针分子通过数据库BLAST检索获得一个来源于Rhodocyclaceae bacterium的醇脱氢酶RbADH，利用大肠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组工程菌，其特征在于：该重组工程菌由以下方法构建而成：S1、利用分子探针技术通过数据库BLAST检索获得的来源于 Rhodocyclaceae bacterium的醇脱氢酶RbADH，其氨基酸序列如SEQ ID. 1所示，其核苷酸序列如SEQ ID. 2所示；S2、根据所述醇脱氢酶RbADH的氨基酸序列合成醇脱氢酶基因，以该醇脱氢酶基因为模板，通过设计特异性引物扩增该醇脱氢酶基因；S3、将扩增得到的醇脱氢酶基因插入含有葡萄糖脱氢酶基因的质粒pETDuet
‑1‑
GDH中，得到重组质粒；S4、将经测序验证的重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），得到共表达醇脱氢酶RbADH和葡萄糖脱氢酶的重组工程菌E. coli
‑
RbADH
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GDH。2.根据权利要求1所述的一种重组工程菌，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶来源于Bacillus megaterium IWG3，且是突变体Q252L。3.如权利要求1或2所述的一种重组工程菌在2,5
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呋喃二甲醇合成中的应用。4.如权利要求1或2所述的一种重组工程菌用于合成2,5
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呋喃二甲醇的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将所述重组工程菌接种至含有100 μg/mL氨苄青霉素钠的Luria
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Bertani液体培养基中，在37 ℃、180 r/min下过夜培养；（2）按1~5%...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，陈伟，
申请(专利权)人：广州顺力聚氨酯科技有限公司，
类型：发明
国别省市：