IGFBP5基因在隐睾症诊断中的应用制造技术

本发明专利技术属于隐睾研究技术领域，公开了IGFBP5基因在隐睾症诊断中的应用。本研究采用隐睾症食蟹猴模型，隐睾睾丸中显著变化的细胞有Leydig。在Leydig细胞中表达的基因表达量增加特别明显的是基因IGFBP5，同时RPS16和ANXA6的表达量也显著增加(P<0.05)。但其他几个基因RPS2、RPL27A、EEF1B2、RPS20等的表达量则为显著下调。因此，可以通过检测待测样本单细胞中基因IGFBP5的表达量，来作为诊断隐睾的手段。从而为隐睾症所致男性不育的研究奠定基础，为临床诊疗方案的研究提供新思路。临床诊疗方案的研究提供新思路。临床诊疗方案的研究提供新思路。

【技术实现步骤摘要】
IGFBP5基因在隐睾症诊断中的应用


[0001]本专利技术涉及隐睾研究
，更具体的，涉及IGFBP5基因在隐睾症诊断中的应用。

技术介绍

[0002]隐睾症是男性中最常见的生殖系统先天性异常之一，男性中约有1％～9％在出生时表现为至少有一个隐睾睾丸。隐睾症增加了男性不育、睾丸癌、生殖细胞丢失和精子发生受损的风险。30.8％的单侧隐睾患者存在少精子症；25％～89％双侧隐睾患者存在无精子症，不育者高达60％～100％。有32％的药物治疗者和46％的外科手术者发展为无精症，单方面隐睾症的无精症发生率为13％，而与患者是否接受治疗无关。目前使用腹腔镜辅助隐睾切除术或者睾丸固定术治疗隐睾。
[0003]目前有研究发现，紧密连接(TJ)相关分子的表达在人工隐睾或睾丸热处理后24～48h显著降低，而血
‑
睾丸屏障(BTB)的通透性增加且在10d后恢复。该过程还伴随着TGF
‑
β2和TGF
‑
β3的表达增高，p38 MAPK和ERK/MAPK信号通路的激活。在隐睾生精过程的相关生物信息学鉴定中发现花生四烯酸途径和mTOR途径被认为是生精的重要途径，而RICTOR和GPX8被认为是参与隐睾症患者生精过程中的关键基因。但是，隐睾症的自身机制和分子通路等尚不清楚。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供基因IGFBP5的应用。
[0005]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0006]物质A在制备诊断隐睾症的功能产品中的应用，所述物质A用于检测细胞中基因IGFBP5的表达量。
[0007]优选的，所述物质A为IGFBP
‑
5抗体。
[0008]研究发现单细胞测序中，同正常侧的睾丸组织相比，IGFBP5在隐睾侧睾丸组织Leydig细胞中高表达，这一点在RT
‑
PCR检测中也得到了验证。因此该基因适用于鉴定是否患有隐睾症。
[0009]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0010]本研究采用隐睾症食蟹猴模型，隐睾睾丸中显著变化的细胞有Leydig。在Leydig细胞中表达的基因表达量增加特别明显的是基因IGFBP5，同时RPS16和ANXA6的表达量也显著增加(P<0.05)。但其他几个基因RPS2、RPL27A、EEF1B2、RPS20等的表达量则为显著下调。
[0011]因此，可以通过检测待测样本单细胞中基因IGFBP5的表达量，来作为诊断隐睾的手段。从而为隐睾症所致男性不育的研究奠定基础，为临床诊疗方案的研究提供新思路。
Enzyme R和25μL Enzyme A，配置成酶解液后，加入剪碎后的组织，拧紧C管，置于组织处理器中37℃消化50min，显微镜下每5min检查一次消化进度，直到消化为单细胞悬浮液。结束后40μm过滤收集细胞悬液。清洗重悬并做裂红处理。再次清洗重悬，使用Dead Cell Removal Kit(#130
‑
090
‑
101，Miltenyi)去除死细胞和碎片，使用1
×
PBS(#70011
‑
004，Gibco)清洗并用适量1
×
PBS重悬细胞，使用Cellometer Auto 2000instrument(#SD
‑
100,Nexcelom Bioscience)对重悬的细胞进行计数观察。最终细胞结团率小于10％且细胞活率大于80％时，准备进行单细胞RNA测序。
[0023]五、RT
‑
PCR验证
[0024]1、NA抽提(枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶)
[0025]1)取匀浆管，加入1mL的RNA提取液，置冰上预冷。
[0026]2)取100mg组织，加入到匀浆管中。
[0027]3)研磨仪充分研磨直至无可见组织块，12000rpm离心10min取上清。
[0028]4)加入250μL三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
[0029]5)4℃下12000rpm离心10min。
[0030]6)将400mL上清转移到一个新的离心管中，加0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
[0031]7)
‑
20℃放置15min。
[0032]8)4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
[0033]9)吸除液体，加入75％乙醇1.5mL洗涤沉淀。
[0034]10)4℃下12000rpm离心5min。
[0035]11)将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
[0036]12)加入15μL无RNA酶的水溶解RNA，55℃孵育5min。
[0037]13)使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μL待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
[0038]14)将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为100～500ng/μL。
[0039]2、转录(枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶)
[0040]1)逆转录反应体系配制(推荐20μL反应体系)，见表6.1。
[0041]2)轻轻混匀并离心。
[0042]3)逆转录程序设置，见表6.2。
[0043]表1逆转录反应体系
[0044][0045]表2逆转录程序
[0046][0047]3、定量PCR
[0048]1)取0.2mL PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
[0049]表3定量PCR反应体系
[0050][0051]2)PCR扩增
[0052]表4PCR反应体系
[0053][0054]4、结果处理
[0055]ΔΔCT法：
[0056]A＝CT(目的基因，待测样本)
‑
CT(内标基因，待测样本)
[0057]B＝CT(目的基因，对照样本)
‑
CT(内标基因，对照样本)
[0058]K＝A
‑
B
[0059]表达倍数＝2
‑
K
。
[0060]实施例1单侧隐睾食蟹猴睾丸单细胞转录组测序分析
[0061]为分析食蟹猴单侧隐睾睾丸中的细胞类型，对单细胞RNA测序数据进行分析。其中，两只实验猴的阴囊侧睾丸命名为CST#1和CST#2，单独消化后制备单细胞悬液，取等量细胞数的单细胞悬液混样后上机测序。隐睾侧睾丸命名为UAT#1和UAT#2，同样在单独消化后制备单细胞悬液，取等量细胞数的单细胞悬液混样后上机测序。通过10
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Genomics平台获取单细胞RNA测序数据。质控后共获取到21457个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.物质A在制备诊断隐睾症的功能产品中的应用，其特征在于，所述物质A用于检测细胞中基因IGFBP5的表达量。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世华，袁靖丽，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：