一种从牛奶中直接获取活性蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种从牛奶中直接获取活性蛋白的方法。本方法采用扩张床吸附技术，以超大孔薄层琼脂糖凝胶－玻璃珠复合介质为吸附介质，采用自下而上的进料方式，牛奶直接通过床层，牛奶中部分活性蛋白被介质吸附，吸附完成后，用一定浓度的氯化钠溶液洗脱，即可获得活性蛋白，该蛋白可直接冷冻干燥。该技术是一种高效集成的分离技术，经一步操作即可得到活性蛋白。整个过程不向牛奶中添加任何物质，操作时间短，产品活性损失小，是一种简捷、高效的获取牛奶中活性蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质分离纯化领域，具体涉及一种采用超大孔薄层琼脂糖凝胶-玻璃珠复合 介质进行扩张床吸附,进而从牛奶中直接获取活性蛋白的方法。
技术介绍
牛奶蛋白质主要由酪蛋白、乳清蛋白等完全蛋白质组成，其所含氨基酸种类齐全、数量 充足、比例适当，适合于人体构成肌肉组织，所以它不但能维持成人健康，还能促进儿童生 长发育。牛奶蛋白质容易消化吸收，消化率高达98%，生物价84，高于猪肉、鱼和植物蛋 白，因而牛奶是人类食物中蛋白质的极好来源。传统的牛奶生产方法一般包括标准化、杀菌、均质、脱气等主要工艺，这些都涉及牛奶 的热处理，影响牛奶中活性物质的活性及牛奶的营养和口感，特别是加热杀菌，如巴氏杀菌 (表1)、超高温杀菌Q34 137'C，保持2 5s)的处理方式。因为高温破坏了蛋白质的三 级四级等高级结构即功能性结构，只保留了蛋白质的低级结构即一级结构(氨基酸)、二级结 构(蛋白肽)，同时破坏了维生素及卵磷脂等营养物质，高温工艺生产的蛋白质营养价值大打 折扣，因而经过传统生产方法得到的牛奶，其中大部分蛋白已失活。表l巴氏杀菌<table>table see original document page 3</column></row><table>现有的从牛奶中提取活性蛋白的技术，主要包括盐沉淀、调节pH值等电点沉淀以及有机 溶剂沉淀等。盐沉淀是在经预处理牛奶中加入硫酸铵等盐溶液，调节盐溶液浓度使活性蛋白 沉淀析出，然后沉淀经膜透析法洗去盐分和离子，干燥得到活性蛋白。调pH值等电点沉淀 是用磷酸或盐酸调节经预处理牛奶的pH值(5 8)，得到活性蛋白沉淀，然后将沉淀经膜透 析法洗去盐分和离子，干燥得到活性蛋白。有机溶剂沉淀是通过调节在经预处理牛奶中加入 的有机溶剂的浓度，使活性蛋白沉淀析出，经过滤后将沉淀干燥得到活性蛋白。彭平等专利技术 的从牛奶中提取乳清蛋白及分离乳清蛋白中不同活性成分的方法(中国专利申请号 200310100350.7)，即采用在牛奶中加入不同浓度的乙醇搅拌均匀，静置后再离心的方法得到 乳清蛋白的不同成分。但是有机溶剂沉淀在室温条件下所得的蛋白质往往已发生变性，必须在低温条件下进行沉淀，且静置时间较长。王秀英等专利技术了一种从牦牛奶中提取的活性乳蛋 白及其方法和应用(中国专利申请号200410040596)，步骤包括原料的选取、离心除杂去脂、 巴斯德低温杀菌、凝乳、离心过滤、除菌浓縮、超滤、离子交换纯化蛋白、无菌过滤、薄膜 蒸发、冷冻干燥及无菌真空包装等。总之，现有的技术都涉及两个以上的步骤，操作繁琐， 因此有必要开发一种简捷高效的从牛奶中获取活性蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简捷、高效的直接从牛奶中大规模提取活性蛋白的方法。 本专利技术提供的利用扩张床吸附技术(也称膨胀床吸附技术)从牛奶中直接获取活性蛋白的方法包括如下步骤利用超大孔薄层琼脂糖凝胶-玻璃珠复合介质进行扩张床吸附试验，待床层稳定后，直接 将牛奶以自下而上的方式进料，乳液直接通过床层，部分活性蛋白被介质吸附。然后用水洗 去滞留在床层中的牛奶，接着用一定浓度的氯化钠溶液进行洗脱，将被吸附的活性蛋白洗脱 下来，进行收集后可直接冻干得到具有活性的蛋白，或用凝胶色谱对蛋白组分进行进一步分 离，可获得高纯度的活性蛋白。所述的扩张床吸附介质为粒径分布在50 300pm之间的超大孔薄层琼脂糖凝胶-玻璃珠 复合介质。该介质为阴离子交换介质，是由琼脂糖凝胶薄层包裹玻璃珠惰性内核所得。该介 质的特点是琼脂糖凝胶壳层的平均厚度大约在20 30pm之间，琼脂糖凝胶层不仅有琼脂糖 凝胶介质所特有的20 50nm的扩散 L，而且有孔径在1 6拜的流通孔，这些超大孔的存在 有利于提高蛋白等在介质内的传质。而玻璃珠惰性内核使得介质具有较大的密度(1.7g/mL)， 縮短了传质路径，加快了传质速率，所以该介质是一种适用于扩张床操作的新型分离介质。所述的牛奶来源于奶牛场的新鲜牛奶，对其进行适当稀释或者直接从中获取活性蛋白。本专利技术提供的从牛奶中直接获取活性蛋白的方法，其特征在于如经过离心、过滤或其他膜 分离过程获取牛奶中的蛋白，易使蛋白变性失活。而直接采用扩张床吸附技术，以自下而上 的进料方式使层析介质膨胀扩张进行吸附，吸附介质处于悬浮状态，颗粒之间存在较大的空 隙，使料液中的固体能够通过。因此利用本专利技术，能够将含有各种活性蛋白及其他杂质的鲜 牛奶直接引入吸附柱，各种杂质直接通过，部分活性蛋白被吸附，实现了从牛奶中直接获取 活性蛋白。实验证明，该技术是一种高效集成的分离技术，仅需一步操作即可得到活性蛋白，有效的 保证了操作过程中牛奶的活性，与现有的生产活性蛋白的方法相比，扩张床吸附操作法时间4短，产品活性损失小，整个过程不向牛奶中添加任何物质，是一种简捷、高效的获取牛奶中 活性蛋白的方法。附图说明图1为超大孔薄层琼脂糖凝胶-玻璃珠复合介质的显微镜照片。图2为用超大孔薄层琼脂糖凝胶-玻璃珠复合介质提取牛奶中活性蛋白的洗脱图谱。图3为用超大孔薄层琼脂糖凝胶-玻璃珠复合介质提取稀释的牛奶中活性蛋白的洗脱图谱。图4为提取的活性蛋白的SDS-PAGE图谱。其中1表示牛奶经0.1 mol/L的NaCl溶液洗 脱得到的洗脱峰；2表示牛奶经0.2mol/L的NaCl溶液洗脱得到的洗脱峰；3表示稀释10倍 的牛奶经0.1mol/L的NaCl溶液洗脱得到的洗脱峰；4表示标准分子量蛋白。具体实施例方式实施例l(1) 床层平衡用超纯水以191cm/h的流速自下而上平衡扩张床吸附介质使床层的膨胀 率为2左右，保持约20 30min，直至扩张床层稳定。其中扩张床吸附介质为粒径分布在 50 300tim之间的超大孔薄层琼脂糖凝胶-玻璃珠复合介质，该介质的具体形态如图1所示。(2) 进料吸附将鲜牛奶直接进样，由于蛋白溶液比水的粘度大，为维持膨胀比不变， 调节进料流速为229cm/h，当与扩张床出口处相连接的核酸蛋白检测仪示数维持不变时，证 明床层中的介质已经吸附饱和，此时停止进料，进料过程中注意保证床层的稳定性。(3) 冲洗进料完毕后，保持床层扩张，以229cm/h的流速通入8 10倍柱体积的超 纯水，清洗去滞留在床层中未被吸附的杂蛋白，直到核酸蛋白检测仪的示数不再变化为止。(4) 洗脱在2 20"C情况下，将床层改为固定床操作，以115cm/h的流速依次通入 0.1mol/L、 0.2 mol/L的NaCl溶液，洗去被吸附的牛奶中的活性蛋白，在核酸蛋白检测仪出 口处收集样品。洗脱图谱如图2所示。图2中洗脱峰A经SDS-PAGE的电泳条带如图4中的 条带1所示。洗脱峰B的电泳条带如图4中的条带2所示。(5) 高盐洗脱以115cm/h的流速用1.0 mol/L的NaCl溶液，洗去与介质结合较牢固 的杂质。的杂质。(6)介质再生用5 10倍扩张床体积的0.01 0.5mol/L碱溶液(优选为NaOH溶液) 冲洗介质。 实施例2(1) 床层平衡用超纯水以191cm/h的流速自下而上平衡扩张床吸附介质约20 30min， 直至扩张床层稳定。其中扩张床吸附介质为粒径分布在50 300pm之间的超大孔薄层琼脂 糖凝胶-玻璃珠复合介质。(2) 进料本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从牛奶中直接获取活性蛋白的方法，包括如下步骤：　利用超大孔薄层琼脂糖凝胶－玻璃珠复合介质进行扩张床吸附试验，待床层稳定后，将牛奶以自下而上的方式进料，乳液直接通过床层，部分活性蛋白被介质吸附。然后用水洗去滞留在床层中的牛奶，接着用 一定浓度的氯化钠溶液进行洗脱，将被吸附的活性蛋白洗脱下来，进行收集后可得到具有活性的蛋白，或用凝胶色谱对蛋白组分进行进一步分离，可获得高纯度的活性蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周鑫，陈晓，铁德馨，代斌，赵艳霞，
申请(专利权)人：周鑫，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]