通过可逆反应定量活细胞内谷胱甘肽的核磁共振方法技术

本发明专利技术公开一种通过可逆反应定量活细胞内谷胱甘肽的核磁共振方法，具体公开一种氟探针，氟探针以吡啶环作为母环，迈克尔受体作为反应官能团并将F或CF3引入反应官能团邻位进行

【技术实现步骤摘要】
通过可逆反应定量活细胞内谷胱甘肽的核磁共振方法


[0001]本专利技术属于检测
，尤其是涉及一种通过可逆反应定量活细胞内谷胱甘肽的核磁共振方法。

技术介绍

[0002]谷胱甘肽(GSH)是生物体内重要的小分子硫醇并发挥着许多重要作用，包括维持细胞氧化还原稳态、细胞增殖分化等。因此，实时定量细胞内谷胱甘肽对监测细胞内生理条件的变化与代谢过程有深刻的见解。然而，利用不可逆探针检测GSH的方法难以实时检测细胞内GSH的含量变化。
[0003]可逆荧光探针的发展能够有效避免GSH的消耗并通过荧光强度变化进行GSH的测定。其中广泛使用的可逆探针主要通过迈克尔受体或亲核取代中心与巯基发生反应。然而，荧光方法检测难以从原子分辨水平实现GSH的活性检测。
[0004]NMR是一种无损伤的方法，可以在原子分辨水平提供丰富的结构信息并在生理条件下实现生物分子广泛时间尺度的动态变化。
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F
‑
NMR由于具有灵敏度高、化学位移范围广、无背景信号干扰等优点，因此适合生物样品分析。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种通过可逆反应定量活细胞内谷胱甘肽的核磁共振方法与技术。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：一种氟探针，结构如式P所示；
[0007][0008]其中，R1为F或CF3；R2为CONH2、COOH或CN。
[0009]优选地，具体为化合物
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F
‑
P1、化合物r/>19
F
‑
P2、化合物
19
F
‑
P3或化合物
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F
‑
P4；
[0010]其中，化合物
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F
‑
P1中，R1为CF3，R2为CONH2；化合物
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F
‑
P2中，R1为F，R2为CONH2；化合物
19
F
‑
P3中，R1为F，R2为COOH；化合物
19
F
‑
P4中，R1为F，R2为CN。
[0011]优选地，式P化合物用作氟探针时，反应官能团为α,β
‑
不饱和氰基，能够与GSH发生可逆反应。
[0012]通过可逆反应定量活细胞内谷胱甘肽的核磁共振方法，其特征在于：向待检测样本中加入如权利要求2所述的氟探针，氟探针与GSH反应生成氟探针
‑
GSH加合物，通过核磁共振进行检测后，氟探针与氟探针
‑
GSH加合物在氟谱上具有不同的化学位移，数据分析后可知待检测样本中GSH含量。
[0013]优选地，当GSH浓度变化时，氟探针与氟探针
‑
GSH加合物的含量比例发生变化，两
种组分峰强度相应发生变化。
[0014]优选地，对细胞内GSH的定量检测和/或对细胞内GSH变化的动态监测。
[0015]优选地，所述待检测样本为含生物硫醇分子的缓冲液、生物流体、血浆、细胞裂解液和细胞样本中的一种或多种的组合。
[0016]优选地，氟探针为化合物
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F
‑
P2。
[0017]优选地，氟探针与GSH能够发生可逆反应。
[0018]本专利技术具有的优点和积极效果是：制备得到的氟探针具有较好的稳定性，与GSH反应迅速，能够快速感应GSH；氟探针仅与生物硫醇发生反应，对其它氨基或羟基等亲核试剂基本不反应，且对于不同的生物硫醇生成的产物具有不同的化学位移，具有很好的选择性和特异性；
[0019]氟探针对细胞低毒，利用
19
F探针与GSH的可逆共价反应通过
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F
‑
NMR实现GSH的定量检测和动态变化研究，并且探针在细胞内无背景信号干扰；具有较好的重复性；
[0020]本专利技术构建了一种有效的核磁分析方法，该方法利用
19
F探针与GSH的可逆共价反应通过
19
F
‑
NMR实现GSH的定量检测和动态变化研究。
附图说明
[0021]图1(a)为
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F探针与GSH的反应机制；(b)
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F
‑
P检测细胞内GSH的原理示意图；
[0022]图2(a)为本专利技术中
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F
‑
P2与不同浓度的GSH反应的
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F
‑
NMR谱图，(b)K
d
拟合曲线；
[0023]图3(a)为本专利技术中
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F
‑
P2对多种弱亲核性试剂反应的
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F
‑
NMR谱图，(b)
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F探针与不同亲核试剂反应后产物与探针强度比；
[0024]图4为本专利技术中
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F
‑
P2对细胞毒性的测试；
[0025]图5(a)为本专利技术中
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F
‑
P2加入细胞样品后的氟谱图；(b)探针
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F
‑
P2与GSH生成产物峰强度与自由探针峰强度的线性拟合曲线；
[0026]图6(a)为本专利技术中
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F
‑
P2加入细胞样品中后逐渐加入NEM的
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F
‑
NMR谱图变化，(b)GSH含量随NEM浓度的变化。
具体实施方式
[0027]下面结合附图对本专利技术的实施例做出说明。
[0028]本专利技术提供一种高效
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F探针，通过可逆方式进行GSH的检测，结构如式P所示，氟探针以吡啶环作为母环，迈克尔受体作为反应官能团并将F或CF3引入反应官能团邻位进行
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F
‑
NMR采集。该探针具有较好的稳定性并能够快速响应GSH，氟探针能够与GSH发生快速可逆反应。在此基础上，利用该方法从原子分辨水平进行细胞内GSH的定量检测并进行GSH变化的动态监测。
[0029][0030]其中，R1为F或CF3；R2为CONH2、COOH或CN。
[0031]本专利技术某些实施例中，氟探针具体为化合物
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F
‑
P1、化合物
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F
‑
P2、化合物
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F
‑
P3或化合物
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F
‑
P4；其中，化合物
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F
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P1中，R1为CF3，R2为CONH2；化合物
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F
‑
P2中，R1为F，R2为CONH2；化合物
19
F
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氟探针，其特征在于：结构如式P所示；其中，R1为F或CF3；R2为CONH2、COOH或CN。2.根据权利要求1所述的氟探针，其特征在于：具体为化合物
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F
‑
P1、化合物
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F
‑
P2、化合物
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F
‑
P3或化合物
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F
‑
P4；其中，化合物
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F
‑
P1中，R1为CF3，R2为CONH2；化合物
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F
‑
P2中，R1为F，R2为CONH2；化合物
19
F
‑
P3中，R1为F，R2为COOH；化合物
19
F
‑
P4中，R1为F，R2为CN。3.根据权利要求1或2所述的氟探针，其特征在于：式P化合物用作氟探针时，反应官能团为α,β
‑
不饱和氰基，能够与GSH发生可逆反应。4.通过可逆反应定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏循成，崔朝玉，李斌，孙忠杰，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：