发夹寡核苷酸及其用途制造技术

在方面中，本发明专利技术提供了包含3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】发夹寡核苷酸及其用途
相关申请的交叉引用
[0001]本专利申请要求2020年11月6日提交的美国临时专利申请第63/110,605号的权益，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。关于联邦资助的研究或开发的声明
[0002]本专利技术是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号HG008935的政府支持下进行的。政府享有本专利技术的某些权利。以电子方式提交的材料通过引用并入
[0003]通过引用整体并入本文的是同此同时提交并如下确定的计算机可读的核苷酸序列表：2021年11月5日创建的名为“757154_ST25.TXT”的一个32,847个字节的ASCII(文本)文件。专利技术背景
[0004]在RNA测序(RNA
‑
seq)中进行的典型酶和化学处理可能在样品回收中呈现显著的障碍，尤其是对于小RNA。另外，由于tRNA的极高丰度，通常在测序文库构建之前通过按大小将tRNA与其它RNA分离来进行小RNA
‑
seq；这种分离可以解开tRNA和其它小RNA的数据关联，这可能丢失有价值的生物信息。此外，基于在文库构建之前和在文库构建期间再次需要凝胶纯化tRNA的方案的RNA
‑
seq方法是低效的，并且需要大量的输入材料。
[0005]最常用的商业RNA
‑
seq试剂盒与还含有转录后修饰的小RNA(<约200个核苷酸)的研究不相容。Small
‑
RNA
‑
seq试剂盒通常依赖于在逆转录前顺序的适配子连接，以便来自修饰的流产性逆转录产物可以使生物学信息和解释存在误差。常规的RNA
‑
seq方法和试剂盒也缺乏处理大量样品所必需的多重水平。
[0006]需要新的RNA
‑
seq文库制备策略和与其一起使用的发夹寡核苷酸。专利技术概述
[0007]在方面中，本专利技术提供了包含3
’‑
末端核苷酸的发夹寡核苷酸，其中所述3
’‑
末端核苷酸的糖组分包含2
’‑
羟基和3
’‑
磷酸。
[0008]在方面中，本专利技术提供了包含3
’‑
末端核苷酸的发夹寡核苷酸，其中所述3
’‑
末端核苷酸的糖位置包含糖的2
’
,3
’‑
二醛氧化产物。
[0009]在方面中，本专利技术提供了发夹寡核苷酸在开发生物标志物中的用途，所述寡核苷酸包含亲和部分和3
’‑
末端核苷酸，其中所述3
’‑
末端核苷酸的糖组分包含2
’‑
羟基和3
’‑
磷酸。
[0010]在方面中，本专利技术提供了包含配体部分和发夹寡核苷酸的固体支持物，所述寡核苷酸包含亲和部分和3
’‑
末端核苷酸，其中所述3
’‑
末端核苷酸的糖组分包含2
’‑
羟基和3
’‑
磷酸，以及其中所述寡核苷酸通过所述发夹寡核苷酸的亲和部分与所述固体支持物的配体部分的结合而固定在所述固体支持物上。
[0011]在方面中，本专利技术提供了制备RNA序列文库的方法，其包括：(a)将RNA序列与发夹寡核苷酸连接以形成构建体，所述寡核苷酸包含3
’‑
末端核苷酸，其中所述3
’‑
末端核苷酸的糖组分包含2
’‑
羟基和3
’‑
磷酸，(b)将所述RNA序列逆转录为cDNA序列，以及(c)使用PCR
扩增所述cDNA序列。
[0012]其它方面如本文所述。附图简述
[0013]图1描绘了根据本专利技术的方面的RNA测序(RNA
‑
seq)文库制备，并显示了寡核苷酸发夹在无效第一连接后经历的过程。
[0014]图2A是根据本专利技术的方面的RNA
‑
seq文库制备的示意图。图2B描绘了在嵌入描述的情况下根据本专利技术的捕获发夹寡核苷酸(CHO)的特征。图2C显示了在具有和没有去甲基化酶处理的情况下来自总RNA
‑
seq文库的最终PCR产物。DNA大小标志物显示在凝胶的左侧。由人tRNA中的m1A58和m1G37修饰引起的主要RT(逆转录酶)终止显示在凝胶的右侧。TdT对应于来自RT的异常末端转移酶活性的产物。图2D显示了在没有和具有去甲基化酶处理的情况下，用不同量的输入总RNA制备的文库的最终PCR产物。图2E显示了在具有和没有去甲基化酶和/或高碘酸盐处理的情况下，从HEK293T总RNA(对照)和人粪便总核酸开始的文库的最终PCR产物。图2F显示了在没有和具有去甲基化酶处理的情况下，多重口腔(舌刮(tongue scrape))微生物组文库的最终PCR产物。
[0015]图3A显示了合成寡核苷酸与发夹寡核苷酸连接的结果。图3B显示了在具有和没有去甲基化酶和/或高碘酸盐处理的情况下逆转录实验的结果，其中连接的寡核苷酸已经固定在固体支持物珠粒上。图3C显示了在第二连接中加入另外的引物后进行的PCR产物，显示了当输入RNA以3
’‑
A或3
’‑
C为末端时，最终产物中几乎没有偏差。图3D显示了去磷酸化步骤的效率。图3E显示了在具有或没有高碘酸盐处理的情况下，具有不同末端核苷酸的发夹寡核苷酸的连接产物。图3F描绘了在一锅测序(one
‑
pot sequencing)中测量tRNA装载的示意图。图3G显示了在没有(
‑
,
‑
)和具有(+,+)图3F所示处理的情况下最终PCR产物。
[0016]图4A描绘了映射至大肠杆菌基因组的RNA
‑
seq结果，揭示了各种类型RNA的存在。图4B描绘了通过测序或通过微阵列杂交测量的tRNA
Arg
或tRNA
Leu
同功受体的相对丰度的比较；每对中左边的浅色点是微阵列数据，每对中右边的深色点是RNA
‑
seq数据。图4C描绘了在具有和没有去甲基化酶处理的情况下由RNA制备的文库的比较。图4D是沿着单独tRNA的突变分数的热图。图4E描绘了在具有和没有去甲基化酶的情况下，在rpm(每分钟读取)>1下非编码RNA转录本的丰度。
[0017]图5A显示了在具有和没有三种急性应激条件下保持10分钟的情况下，来自生长在LB中的大肠杆菌的总RNA的生物学重复中的RNA转录本丰度的相关性。图5B显示了用去甲基化酶处理和未处理的样品的转录本丰度之间的关系。图5C显示了在具有和没有去甲基化酶处理的情况下文库中沿着tRNA
Pro
(GGG)的突变率。图5D显示了在具有和没有去甲基化酶处理的情况下沿着tRNA
Pro
(GGG)的读取密度。图5E描绘了在不同应激和无应激对照期间三种应激响应小本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.发夹寡核苷酸，其包含3
’‑
末端核苷酸，其中所述3
’‑
末端核苷酸的糖组分包含2
’‑
羟基和3
’‑
磷酸。2.如权利要求1所述的发夹寡核苷酸，其中所述3
’‑
末端核苷酸的糖组分是戊糖，并且所述戊糖是核糖。3.发夹寡核苷酸，其包含3
’‑
末端核苷酸，其中所述3
’‑
末端核苷酸的糖位置包含糖的2
’
,3
’‑
二醛氧化产物。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的发夹寡核苷酸，其还包含5
’‑
末端核糖核苷酸。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的发夹寡核苷酸，其还包含：(a)条形码序列，(b)所述发夹环内部的亲和部分标记的核苷酸，以及(c)引物结合位点。6.如权利要求5所述的发夹核苷酸，其包含以下序列：5
’‑
Phos
‑
rA CT
‑
X
‑
AGA TCG GAA GAG CAC ACG AT(SEQ ID NO:86)
‑
LT
‑
AGA CGT GTG CTC TTC CGA TCT(SEQ ID NO:87)
‑
Z
‑
AG rU
‑3’‑
Phos，其中X是至少3、4、5或6个核苷酸的条形码，LT是亲和部分标记的胸腺嘧啶核苷酸，以及Z是为所述条形码序列反向互补物的核苷酸序列。7.如权利要求5所述的发夹核苷酸，其包含以下序列：5
’‑
Phos
‑
rA CT
‑
X
‑
GAT CGT CGG ACT GTA GAA CAT(SEQ ID NO:88)
‑
LT
‑
AG AGT TCT ACA GTC CGA CGA TC(SEQ ID NO:89)
‑
Z
‑
AG rU
‑3’‑
Phos,其中X是至少3、4、5或6个核苷酸的条形码，LT是亲和部分标记的胸腺嘧啶核苷酸，以及Z是为所述条形码序列反向互补物的核苷酸序列。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的发夹寡核苷酸，其固定在固体支持物上。9.权利要求1
‑
8中任一项所述的发夹寡核苷酸在制备RNA序列文库中的用途。10.权利要求1
‑
8中任一项所述的发夹寡核苷酸在制备RNA序列文库的多重方法中的用途。11.权利要求1
‑
8中任一项所述的发夹寡核苷酸在开发生物标志物中的用途。12.如权利要求11所述的用途，其中所述生物标志物是从液体活检中开发的。13.如权利要求11或12所述的用途，其中开发所述生物标志物包括产生tRNA片段化谱。14.权利要求1
‑
8中任一项所述的发夹寡核苷酸在开发病毒性疾病严重程度的生物标志物中的用途。15.权利要求1
‑
8中任一项所述的发夹寡核苷酸在开发针对癌症的生物标志物中的用途。16.固体支持物，其包含配体部分和发夹寡核苷酸，所述寡核苷酸包含亲和部分和3

【专利技术属性】
技术研发人员：潘滔，克里斯托弗，
申请(专利权)人：芝加哥大学，
类型：发明
国别省市：