本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种斜纹夜蛾致死基因titin及其应用。本发明专利技术要解决的技术问题是为昆虫生物防治提供一种新选择。本发明专利技术的技术方案是一种斜纹夜蛾致死基因titin的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术还提供了所述斜纹夜蛾致死基因titin或/和编码蛋白在昆虫防治中的应用。本发明专利技术通过降低基因titin在斜纹夜蛾幼虫中的表达，造成幼虫发育受到抑制，甚至死亡；为实现斜纹夜蛾的绿色精准防控提供了一种新选择。纹夜蛾的绿色精准防控提供了一种新选择。纹夜蛾的绿色精准防控提供了一种新选择。
【技术实现步骤摘要】
一种斜纹夜蛾致死基因titin及其应用
[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种斜纹夜蛾致死基因titin及其应用。
技术介绍
[0002]斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)属于鳞翅目夜蛾科，是一种世界性分布的重要农业害虫，可严重危害棉花、大豆、烟草等多种重要的经济作物，对亚洲、非洲、南美和一些大洋洲地区经济作物造成严重损失。斜纹夜蛾主要在我国的东南地区发生较为严重。斜纹夜蛾是烟草生长中、后期的主要害虫，发生严重时会给烟农造成巨大的损失。为减少经济损失，生产上常通过化学防治来控制斜纹夜蛾，但长期使用一种或者一类化学药剂常导致该虫的抗药性不断增强，而且在叶片成熟期用药存在农药残留的风险。所以，生产上迫切需要创制防治斜纹夜蛾的环境友好型新方法。
[0003]RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double
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strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。以RNAi为基础的害虫防治技术，通过干扰控制害虫发育或重要行为的关键基因，阻碍害虫正常的生长、发育和繁殖，甚至直接导致害虫死亡，从而达到害虫防治的目的。基于RNA的害虫管理策略现在被用于一些昆虫和病毒的控制，未来可能用于控制其他有害生物，如杂草、线虫、真菌和细菌。RNAi还有潜力有效控制农业害虫和病媒的杀虫剂抗性，并破坏动植物病毒载体，以及控制入侵物种。由于dsRNA在生物体内是普遍存在的，而且在环境中易降解，因此无毒、无残留，对环境无污染，是一种新型绿色环保的害虫防控方法，其应用前景十分广阔。
[0004]碳量子点(Carbon quantum dots,CQDs)是一种粒径在10nm以下的纳米粒子，由于其水溶性好，毒性极低，近年来备受关注。
技术实现思路
[0005]本专利技术要解决的技术问题是为昆虫生物防治提供一种新选择。
[0006]本专利技术的技术方案是一种斜纹夜蛾致死基因titin的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0007]进一步的，本专利技术还提供了一种斜纹夜蛾致死基因titin，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.12所示。
[0008]本专利技术还提供了所述斜纹夜蛾致死基因titin或/和编码蛋白在昆虫防治中的应用。
[0009]进一步的，所述昆虫为鳞翅目夜蛾科昆虫。
[0010]进一步的，所述昆虫为斜纹夜蛾。
[0011]本专利技术还提供一种昆虫防治的方法，其主要步骤为降低昆虫体内基因titin的表达。
[0012]进一步的，所述采用RNAi技术降低昆虫体内基因titin的表达。
[0013]特别的，所述dstitin的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
[0014]具体的，扩增dstitin的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
[0015]具体的，采用dstitin注射和喂养昆虫。
[0016]其中，所述注射为注射2龄幼虫。
[0017]进一步的，将dsRNA与碳量子点混合后注射。
[0018]具体的，所述dsRNA和碳量子点浓度均为100ng/μL。
[0019]优选的，碳量子点的用量过载。
[0020]具体的，所述喂养为喂养表达dstitin的菌液。
[0021]特别的，所述菌液的获得方式如下：将SEQ ID No.11所示的dstitin构建到表达载体上，然后转化大肠杆菌，培养后灭活菌体，冷冻离心，收集沉淀。
[0022]进一步的，所述表达载体为L4440载体。
[0023]进一步的，所述昆虫为鳞翅目夜蛾科昆虫。
[0024]进一步的，所述昆虫为斜纹夜蛾。
[0025]本专利技术还提供了降低基因titin表达的物质，为采用RNAi干扰基因表达的dsRNA。
[0026]具体的，扩增dstitin的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
[0027]特别的，所述dstitin的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
[0028]本专利技术还提供了所述降低基因titin表达的物质在昆虫防治中的应用。
[0029]本专利技术的有益效果：本专利技术合成的针对titin基因的dsRNA在注射斜纹夜蛾二龄幼虫后会造成幼虫发育受到抑制，甚至死亡。经RT
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qPCR验证，二龄幼虫注射48h后，titin表达量出现了下调。后续还通过在dsRNA添加碳量子点的方法，防止dsRNA被降解，提高干扰效率。本专利技术的dsRNA是针对斜纹夜蛾的特异性基因设计，不会改变斜纹夜蛾的基因组，仅对斜纹夜蛾具有杀灭效果，具有特异性强、安全性高、致死率高、环境友好等优点，可实现斜纹夜蛾的绿色精准防控，能够有效减少化学农药对生态环境的破坏。本专利技术还引入了纳米材料(碳量子点)作为dsRNA的载体，有效提高了dsRNA的沉默效率。
附图说明
[0030]图1RNA干扰对斜纹夜蛾死亡率的影响；dstitin代表针对基因titin设计的dsRNA；dsGFP代表针对基因GFP设计的dsRNA。
[0031]图2注射48h后dsRNA对斜纹夜蛾ATPd基因的沉默效果；纵坐标为基因相对表达水平。
[0032]图3碳量子点结构示意图。
[0033]图4碳量子点(CQDs)与dsRNA结合后电泳检测结果；第1泳道为对照条带，6条带分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp；后面其余泳道为CQDs与dsRNA按dsRNA︰CQDs的体积比依次为1︰0、2︰1、3︰1、4︰1、5︰1、10︰1、11︰1、12︰1、13︰1、14︰1、15︰1、20︰1均匀混合之后的电泳条带。
[0034]图5纳米载体介导注射48h后dsRNA对斜纹夜蛾titin基因的沉默效果；纵坐标为基因相对表达水平。
[0035]图6titin构建的L4440载体。
[0036]图7titin菌液饲喂斜纹夜蛾死亡率。
具体实施方式
[0037]在实验前期，通过Web of Science数据库检索所有与昆虫RNAi相关的研究，通过查阅文献，并从中筛选出在文章里对各个目的目标害虫(如鳞翅目、脉翅目、膜翅目、双翅目等)致死效果高于50％的基因，获得66个致死率在50％以上的基因，并通过NCBI查找相关基因在斜纹夜蛾中的同源基因，从一系列同源基因里找到与斜纹夜蛾高度同源且的基因作为候选靶基因。再进一步的，采用RNA
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Seq高通量测序技术分析了斜纹夜蛾从卵期到成虫期差异表达的基因，在上调的基因里面筛选在1龄、2龄、3龄里都上调表达的基因。最后共筛选得到斜纹夜蛾40个基因作为候选基因。
[0038]然后，分别对40个候选基因设计了dsRNA，通过显微注射的方法注射斜纹夜蛾二龄本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.斜纹夜蛾致死基因titin的编码蛋白在昆虫防治中的应用，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.斜纹夜蛾致死基因titin在昆虫防治中的应用，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ IDNo.12所示。3.一种昆虫防治的方法，其特征在于：其主要步骤为降低昆虫体内基因titin的表达。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述采用RNAi技术降低昆虫体内基因titin的表达。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述RNAi技术中，扩增dstitin的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述dstitin的核苷酸序列如SEQ ID No...
【专利技术属性】
技术研发人员：桑文，秦鹏，张梦珂，孟建玉，阳显斌，汪汉成，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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