【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产腺病毒的方法
[0001]本专利技术涉及用于生产腺病毒的方法。更特别地，本专利技术涉及用于生产适合在疫苗中使用的腺病毒的方法，并且涉及用于在生产期间提高腺病毒的产量的方法。
技术介绍
[0002]腺病毒是双链DNA病毒，其具有大约为26
‑
46kb的基因组。腺病毒具有物种特异性并且已从多种哺乳动物物种中分离出不同的血清型。人腺病毒无处不在，大多数人都已感染了一种或多种血清型，导致终身免疫。
[0003]修饰的腺病毒可用作载体来递送编码外源抗原的DNA。此类腺病毒载体通常是复制缺陷型腺病毒载体，其必需的E1A和E1B基因被缺失并被具有高活性启动子(例如驱动异源基因表达的巨细胞病毒立即早期启动子)的表达盒替换。
[0004]复制缺陷型腺病毒载体已广泛用于疫苗，因为它们会诱导对由载体编码的异源基因的强烈的体液和T细胞应答。一项研究基于复制缺陷型Ad5的疫苗用于在治疗结核病中使用的临床试验的结果似乎有非常好的前景(Smail等人2013；Sci.Transl.Med.[科学
·
转化医学]10月2日；5(205):205ra134)。尽管如此，目前生产此类腺病毒的方法效率低且缺乏可扩大性(scalability)。
[0005]因此，需要生产腺病毒的改进的方法。
技术实现思路
[0006]本专利技术至少部分涉及开发改进的腺病毒生产方法，与替代的生产方法相比，这些方法是高度可扩大的并且提供了提高的腺病毒载体滴度。因此，本专利技术的方法非常有利，特别是...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产用于在疫苗中使用的腺病毒的方法，该方法包括：(a)以不足以感染细胞群中所有细胞的MOI向培养的细胞群中添加腺病毒；(b)在允许该细胞群被该腺病毒感染的条件下培养该细胞群以提供包含腺病毒感染的细胞的细胞群；(c)在允许该腺病毒复制的条件下培养该包含腺病毒感染的细胞的细胞群；和(d)从培养物中收获该腺病毒。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括以约0.01
‑
1的MOI，优选以约0.025
‑
0.4的MOI，最优选以约0.1的MOI，向该细胞群中添加该腺病毒。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(a)包括在用该细胞群接种细胞培养基后约0
‑
48小时，向该细胞群中添加该腺病毒。4.如权利要求3所述的方法，其中步骤(a)包括在用该细胞群接种细胞培养基后约24小时，向该细胞群中添加该腺病毒。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法的特征在于第一感染和第二感染，其中该第一感染提供了第一部分的腺病毒感染的细胞并且是通过向该细胞群中添加该腺病毒诱导的，并且其中该第二感染提供了第二部分的腺病毒感染的细胞并且是通过由第一部分的腺病毒感染的细胞释放到培养物中的腺病毒诱导的。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法包括将该细胞群所暴露的温度从第一温度转换到第二温度，其中该第一温度和第二温度允许该细胞群被该腺病毒感染。7.如权利要求6所述的方法，其中将该细胞群暴露于该第二温度使培养物中的该腺病毒的稳定性提高。8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其中将该细胞群暴露于该第二温度使培养物中的腺病毒颗粒:感染性颗粒比率降低。9.如权利要求6
‑
8中任一项所述的方法，其中该第二温度允许该细胞群的生长。10.如权利要求6
‑
9中任一项所述的方法，其中这些允许该细胞群被该腺病毒感染的条件包括在该第一温度下培养该细胞群，并且这些允许该腺病毒复制的条件包括在该第二温度下培养该细胞群。11.如权利要求6
‑
10中任一项所述的方法，其中该方法包括在向该细胞群中添加该腺病毒后约48
‑
96小时，将该细胞群所暴露的温度从该第一温度转换到该第二温度。12.如权利要求11所述的方法，其中该方法包括在向该细胞群中添加该腺病毒后约72小时，将该细胞群所暴露的温度从该第一温度转换到该第二温度。13.如权利要求6
‑
12中任一项所述的方法，其中该第一温度高于该第二温度。14.如权利要求6
‑
13中任一项所述的方法，其中该第一温度是约31℃
‑
40℃，优选地约35℃
‑
38℃，最优选地约37℃。15.如权利要求6
‑
14中任一项所述的方法，其中该第二温度是约27
‑
40，优选地约31℃
‑
35℃，最优选地约33℃。16.如权利要求6
‑
15中任一项所述的方法，其中该细胞群在该第一温度下培养至少约72小时。17.如权利要求16所述的方法，其中该细胞群在该第一温度下培养至少约96小时。18.如权利要求6
‑
17中任一项所述的方法，其中该细胞群在该第二温度下培养至少约
48小时。19.如权利要求6
‑
18中任一项所述的方法，其中该细胞群在该第二温度下培养直到从培养物中收获该腺病毒。20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在具有至少约1L、优选至少约1.2L、至少约3L、约50L、约1000L、约2000L、约3000L、或约5000L、最优选至少约2000L的容量的生物反应器中培养该细胞群。21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法不包括在向该细胞群中添加该腺病毒后，替换细胞培养基或向该细胞群中添加细胞培养基的步骤。22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法包括向该细胞群中添加细胞培养添加剂。23.如权利要求22所述的方法，其中该细胞培养添加剂包含DMSO、丁酸钠和/或CaCl2。24.如权利要求22或23所述的方法，其中在向该细胞群中添加细胞培养添加剂后，将该细胞群暴露于DMSO，优选约0.5％或1％DMSO。25.如权利要求22
‑
24中任一项所述的方法，其中在向该细胞群中添加细胞培养添加剂后，将该细胞群暴露于丁酸钠，优选约1mM丁酸钠。26.如权利要求22
‑
25中任一项所述的方法，其中在向该细胞群中添加细胞培养添加剂后，将该细胞群暴露于CaCl2，优选约2mM CaCl2。27.如权利要求22
‑
26中任一项所述的方法，其中该方法包括在步骤(c)期间，向该细胞群中添加该细胞培养添加剂。28.如权利要求22
‑
27中任一项所述的方法，其中该方法包括向该细胞群中添加该腺病毒后约72
‑
120小时，向该细胞群中添加该细胞培养添加剂。29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法包括向该细胞群中添加补料。30.如权利要求29所述的方法，其中该方法包括在向该细胞群中添加该腺病毒后约24
‑
48小时，向该细胞群中添加该补料。31.如权利要求29
‑
30中任一项所述的方法，其中该方法包括至少每48小时向该细胞群中添加该补料。32.如权利要求30或权利要求31所述的方法，其中该方法包括以约5％v/v的最终浓度向该细胞群中添加该补料。33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该细胞群与向该细胞群中添加的该腺病毒互补。34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该细胞群包含哺乳动物细胞。35.如权利要求34所述的方法，其中该哺乳动物细胞表达腺病毒复制因子。36.如权利要求34或权利要求35所述的方法，其中该细胞群包含HEK细胞。37.如权利要求34
‑
36中任一项所述的方法，其中该细胞群包含T
‑
REx细胞。38.如权利要求34所述的方法，其中该细胞群由T
‑
REx细胞组成。39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该腺病毒是复制缺陷型腺病毒。40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该腺病毒是猿腺病毒。41.如权利要求40所述的方法，其中该猿腺病毒是复制缺陷型猿腺病毒。42.如权利要求41所述的方法，其中该复制缺陷型猿腺病毒是ChAdOx1、ChAdOx2、
ChAdOx3、或ChAd63，优选地其中该复制缺陷型猿腺病毒是ChAdOx1。43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该腺病毒不是人腺病毒。44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该腺病毒编码nCov
‑
19刺突蛋白。45.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在向该细胞群中添加腺病毒后约96
‑
144小时，进行从培养物中收获该腺病毒的步骤。46.如权利要求45所述的方法，其中在向该细胞群中添加腺病毒后约120小时，进行从培养物中收获该腺病毒的步骤。47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该从培养物中收获该腺病毒的步骤包括裂解该细胞群的细胞和从该细胞群的细胞裂解物中收获腺病毒。48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该从培养物中收获该腺病毒的步骤包括从培养该细胞群的细胞培养基中收获腺病毒。49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，该方法包括将细胞接种于细胞培养容器中。50.如权利要求49所述的方法，其中在步骤(a)之前，该方法包括以至少约0.5x106个细胞/mL、优选至少约0.8x106个细胞/mL、最优选至少约1.2x106个细胞/mL的初始细胞密度，将细胞接种于细胞培养容器中以提供培养的细胞群。51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法包括向培养的具有至少约1x106个细胞/mL的活细胞密度的细胞群中添加该腺病毒。52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在向该细胞群中添加该腺病毒后约6
‑
8天出现峰值病毒滴度。53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些允许该细胞群被该腺病毒感染的条件是允许细胞生长的条件。54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些允许该腺病毒复制的条件是允许细胞生长的条件。55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该疫苗是COVID
‑
19疫苗。56.一种生产用于在疫苗中使用的腺病毒的方法，该方法包括在允许第二部分的该细胞群被该腺病毒感染的条件下培养包含第一部分的腺病毒感染的细胞的细胞群，其中该第二部分的该细胞群被由该第一部分的腺病毒感染的细胞释放到培养物中的腺病毒感染。57.如权利要求56所述的方法，其中在允许第二部分的该细胞群被该腺病毒感染的条件下培养包含第一部分的腺病毒感染的细胞的细胞群之前，该方法包括在允许该细胞群中的第一部分的细...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋金林，N，
申请(专利权)人：阿斯利康英国有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。