PITX2基因作为标志物在检测肺癌中的应用制造技术

本发明专利技术公开了PITX2基因作为标志物在检测肺癌中的应用。本发明专利技术发现与早期肺癌诊断相关的基因为PITX2基因，它是从肺癌组织及癌旁正常组织提取的DNA和RNA，用全基因甲基化测序和表达分析法，经用另一组肺癌组织和正常人组织DNA进行筛选验证后原创结果。在肺组织中，PITX2基因检测肺癌的敏感度达到74％，特异性为94％。在血浆中，PITX2基因检测肺癌的敏感度达到58％，特异性为85％。由此可见，单个PITX2基因能够在血浆或肺组织中检测肺癌。本发明专利技术可对早期肺癌进行筛查及辅助诊断，具有重要的应用价值。用价值。

【技术实现步骤摘要】
NO：5所示的引物PITX2
‑
R2和SEQ ID NO：6所示的探针PITX2
‑
P2组成。
[0012]上述任一所述引物探针组PITX2
‑
3由SEQ ID NO：7所示的引物PITX2
‑
F3、SEQ ID NO：8所示的引物PITX2
‑
R3和SEQ ID NO：9所示的探针PITX2
‑
P3组成。
[0013]上述任一所述试剂盒还可包括用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组。
[0014]上述任一所述试剂盒具体可由上述任一所述用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组和上述任一所述用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组组成。
[0015]所述内参基因可为ACTB基因。ACTB基因的Gene ID为60。
[0016]上述任一所述用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组可为引物探针组ACTB
‑
1或引物探针组ACTB
‑
2。
[0017]所述引物探针组ACTB
‑
1由SEQ ID NO：10所示的引物ACTB
‑
F1、SEQ ID NO：11所示的引物ACTB
‑
R1和SEQ ID NO：12所示的探针ACTB
‑
P1组成。
[0018]所述引物探针组ACTB
‑
2由SEQ ID NO：13所示的引物ACTB
‑
F2、SEQ ID NO：14所示的引物ACTB
‑
R2和SEQ ID NO：15所示的探针ACTB
‑
P2组成。
[0019]上述任一所述探针(如检测内参基因的探针、检测PITX2基因甲基化水平的探针)的一端均具有荧光标记，另一端均具有荧光猝灭标记。
[0020]上述任一所述试剂盒的检测对象具体可为肺结节组织的基因组DNA、血浆cfDNA或粪便cfDNA。
[0021]上述任一所述试剂盒还可包括数据处理系统；所述数据处理系统将PITX2基因的甲基化水平转化为待测者的dCT
PITX2
，用于判断待测者是否为肺癌患者；
[0022]所述待测者的dCT
PITX2
的计算方法为：将待测者的肺结节组织的基因组DNA、血浆cfDNA或粪便cfDNA进行化学修饰，之后以其作为模板、采用权利要求3和/或6中的引物和探针进行荧光PCR扩增，收集荧光信号，分别获得PITX2和ACTB的CT值，依次记为CT
PITX2
和CT
ACTB
；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45；进一步计算PITX2的dCT值，dCT
PITX2
＝CT
PITX2
‑
CT
ACTB
；
[0023]所述判断的方法为：如果待测者的PITX2基因发生甲基化，则待测者为肺癌患者；否则待测者不为肺癌患者；PITX2基因是否发生甲基化通过比较待测样本PITX2基因的dCT和dCT临界值来实现；
[0024]如果待测者PITX2基因的dCT<dCT临界值，则待测者基于PITX2基因发生甲基化；如果待测者PITX2基因的dCT≥dCT临界值，则待测者基于PITX2基因未发生甲基化。
[0025]当上述任一所述试剂盒的检测对象为肺结节组织的基因组DNA时，dCT临界值是通过比较大量病例证实的或数据库记载的肺癌组织和癌旁正常组织的PITX2基因dCT值后的一个平均统计的dCT值，即临界值(阈值)，它是能够最大区分肺癌和非肺癌的一个临界dCT值。
[0026]当上述任一所述试剂盒的检测对象为血浆cfDNA时，dCT临界值是通过比较大量病例证实的或数据库记载的已确诊肺癌患者和健康志愿者的血液中PITX2基因的dCT值后的一个平均统计的dCT值，即临界值(阈值)，它是能够最大区分肺癌和非肺癌的一个临界dCT值。
[0027]本专利技术还保护PITX2基因作为标志物在肺癌早期筛查中的应用。
[0028]上述任一所述肺癌分可为非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
[0029]所述非小细胞肺癌可为肺腺癌或肺鳞癌。
[0030]本专利技术发现与早期肺癌诊断相关的基因为PITX2基因，它是从肺癌组织及癌旁正常组织提取的DNA和RNA，用全基因甲基化测序和表达分析法，经用另一组肺癌组织和正常人组织DNA进行筛选验证后原创结果。在肺组织中，PITX2基因检测肺癌的敏感度达到74％，特异性为94％。在血浆中，PITX2基因检测肺癌的敏感度达到58％，特异性为85％。由此可见，单个PITX2基因能够在血浆或肺组织中检测肺癌，且操作简单、耗时短、具有较高的灵敏度和特异性。PITX2基因也可以联合已知用于检测肺癌的靶基因诊断早期肺癌，可以有效提高检出率。本专利技术可对早期肺癌进行筛查及辅助诊断，具有重要的应用价值。
具体实施方式
[0031]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0032]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]下述实施例中，“待测样本”指待检测的核酸样本；具体的，待测样本可以是分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种、细胞系、肺灌洗液、组织切片、手术组织、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、尿、血浆、血清、全血等gDNA，cfDNA和ctDNA。
[0034]下述实施例中，“肺癌”包括腺癌和鳞癌，是呼吸道中常见的恶性肿瘤，特别是非小细胞肺癌。早期症状不明显，从开始癌变发展到临床发现肿块大约5～7年；早期肺癌5年存活率达90以上，晚期则只有10％。
[0035]下述实施例中，“目标核酸”或“靶基因”指人PITX2基因的核酸片段，即人PITX2基因的甲基化DNA特异性片段。设计了高度特异的引物来扩增出不同的目的片段，并用高度特异的探针来识别，且设计的引物与探针能与待测位点互补。
[0036]下述实施例中，“探针”指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸，其核苷酸序列结构与目标核酸基本互补，可以与“目标核酸”形成双链。所述探针的5
’
末端可以携带荧光集团和/或3
’
末端携带淬灭集团标记物。引物和探针与样品DNA中甲基化特异性序列的结合，使分子标记物能够检测出疾病—肺癌。
[0037]本专利技术的方法中，需要对提取的DNA进行化学修饰，获得经过转换的DNA片段作为待测样品。亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐或肼盐修饰均可应用于该种化学修饰，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PITX2基因作为标志物在制备肺癌检测试剂盒中的应用；PITX2基因的GeneID为5308。2.一种用于筛查肺癌试剂盒，包括用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组；PITX2基因的GeneID为5308。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组PITX2
‑
1、引物探针组PITX2
‑
2或引物探针组PITX2
‑
3；引物探针组PITX2
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1由SEQ ID NO：1所示的引物PITX2
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F1、SEQ ID NO：2所示的引物PITX2
‑
R1和SEQ ID NO：3所示的探针PITX2
‑
P1组成；引物探针组PITX2
‑
2由SEQ ID NO：4所示的引物PITX2
‑
F2、SEQ ID NO：5所示的引物PITX2
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R2和SEQ ID NO：6所示的探针PITX2
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P2组成；引物探针组PITX2
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3由SEQ ID NO：7所示的引物PITX2
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F3、SEQ ID NO：8所示的引物PITX2
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R3和SEQ ID NO：9所示的探针PITX2
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P3组成。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述内参基因为ACTB基因；ACTB基因的GeneID为60。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组ACTB
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1或引物探针组ACTB
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2；引物探针组ACTB
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1由SEQ ID NO：10所示的引物ACTB
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：胡立夫，南熠郎，
申请(专利权)人：胡立夫，
类型：发明
国别省市：