一种FcRn结合纳米颗粒及其用途制造技术

本公开涉及一种铁蛋白

【技术实现步骤摘要】
一种FcRn结合纳米颗粒及其用途


[0001]本公开属于重组融合蛋白治疗药物领域。具体地，本公开涉及一种FcRn结合纳米颗粒及其用途，涉及适合用于治疗FcRn靶点相关疾病的重组融合铁蛋白药物。

技术介绍

[0002]新生儿Fc受体(Neonatal Fc receptor,FcRn)在妊娠期和哺乳期表达起到跨越胎盘屏障和肠道运输IgG的作用，严格依赖pH值与IgG的Fc结构域结合，保护IgG不被溶酶体降解。在IgG中，位于Fc上CH2和CH3域之间的位点介导与FcRn的相互作用，其中结合可以让来自内体的内吞抗体再循环到血流中(Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol.12：181
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220；Ghetie et al，2000，Annu Rev Immunol.18：739
‑
766)，从而赋予IgG 1
‑
3周的半衰期。
[0003]除了在抗体转运中起关键作用，Fc与FcRn的结合位点也是细菌蛋白A和G结合的位点。与这些蛋白的紧密结合通常可以用作蛋白纯化，使用蛋白A或蛋白G亲和色谱法纯化抗体Fc。因此，研究者将目的蛋白与Fc与FcRn的结合片段构建成融合蛋白，可更好的分离目的蛋白。
[0004]此外，FcRn也是一个潜在的药物靶点，其负责将与其结合的Fc融合蛋白转移到新生儿的肠道和成年人的肠上皮腔中(Ghetie and Ward，Annu.Rev.Immunol.，2000，18：739
‑<br/>766；Yoshida et al.，Immunity，2004，20(6)：769
‑
783)。FcRn的高亲和力尤其对IgG介导的如重症肌无力、类风湿性关节炎或寻常天疱疮等自身免疫性疾病造成有害影响。靶向FcRn，抑制FcRn循环可使IgG分解代谢增强，导致整体IgG和致病自身抗体水平降低，有望降低所有IgG引起的自身免疫异常。有研究证实，与重症肌无力的治疗性血浆置换疗法相比，以FcRn靶点的治疗方法可以提供更快速和更具选择性的IgG降低效果。另外，与临床使用的许多常规疗法相比，这种治疗方法优势突出也体现在IgA、IgD、IgE和IgM不依赖于FcRn介导的循环，因此它不会导致广泛的免疫抑制，为FcRn靶向的安全性和精准特异性提供了基础。
[0005]目前在临床试验中评估的靶向FcRn抗体药物多为抗体，包括Orilanolimab(SYNT001)、Efgartigimo和Nipocalimab(M281)等。Nipocalimab(M281)是Momenta公司开发的一款潜在“best
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in
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class”抗FcRn抗体，具有治疗多种自身免疫性疾病的潜力，由强生引进。和铂医药2018年从HanAll Biopharma引进的Batoclimab，也是一款靶向新生儿Fc受体(FcRn)的全人源抗体。抗体制备筛选过程复杂，临床前开发周期长，成本高昂，因此仍需开发快速、经济、稳定的FcRn靶向药物。
[0006]天然铁蛋白由两种不同的铁蛋白亚基(H亚基和L亚基)构成，H亚基和L亚基的分子质量分别为21KD和19KD。典型的铁蛋白结构是由24个轻链/重链亚基自组装形成的球壳状结构，外径12nm，内部形成直径8nm的内腔结构。通过重组方式制备重链铁蛋白(HFn)目前可通过融合蛋白表达的方式，将功能性蛋白(如抗体、能够与受体结合的配体肽、小分子肽药物、细胞凋亡前肽、荧光蛋白等)表达于HFn的N端或者C端，以赋予HFn靶向性、示踪性或治疗性(融合方式构建的文献参见：WO2017039382A1，WO2016122259A1，KR
‑
2018008349，
WO2013055058A2，WO2018012952A1，CN104017088A，“Ferritin nanocages with biologically orthogonal conjugation for vascular targeting and imaging”等)。目前，通过原核表达的方式能够稳定、快速、经济的获得HFn融合蛋白，因此其被认为具有良好的药物载体开发潜力和成药性。

技术实现思路

[0007]本公开利用铁蛋白作为药物载体的独特优势，将具有结合FcRn活性的肽段的编码序列连接于铁蛋白突变体单体亚基的N端或C末端(或截断了C端一个α
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螺旋的截短序列，或插入DEloop之间)，从而构建多个铁蛋白与具有结合FcRn活性的肽段的融合蛋白，所述的融合蛋白能够自组装成为24聚体，从而形成在铁蛋白表面能展示多个具有结合FcRn活性的肽段的多价纳米治疗药物，在延长了肽治疗药物的半衰期的同时，达到高亲和力，多价结合的效果。
[0008]本公开提供了2条具有结合FcRn活性的肽段，其均来自于人IgG的Fc区域的肽段，具有结合FcRn的活性。
[0009]本公开用于构建融合蛋白的铁蛋白单体亚基序列经过了点突变改造，能够减少聚集体生成、提高蛋白可溶性表达和组装成功率。
[0010]本公开提供了铁蛋白的单体亚基的片段，使得阻遏肽段连接于铁蛋白C端时能够展示在铁蛋白外表面。
[0011]具体来说，本公开提出了如下技术方案：
[0012]在一方面，本公开提供了一种融合蛋白。
[0013]在一方面，本公开提供了一种包含融合蛋白的纳米颗粒。
[0014]在一方面，本公开提供了一种用于生产前述融合蛋白或纳米颗粒的方法。
[0015]在一方面，本公开提供了一种融合蛋白药物组合物。
[0016]在一方面，本公开提供了一种生成针对与FcRn靶点相关的疾病的药物的方法。
[0017]在一方面，本公开提供了一种核酸分子。
[0018]在一方面，本公开提供了一种表达构建体。
[0019]在一方面，本公开提供了一种重组细胞。
[0020]在一方面，本公开提供了前述融合蛋白、纳米颗粒、药物组合物或核酸分子、表达构建体、重组细胞在制备与FcRn靶点相关的疾病的药物中的用途。
[0021]与现有技术相比，本公开具有如下有益效果：
[0022](1)本公开构建的铁蛋白
‑
Fc融合蛋白能够自组装形成笼状蛋白，多个具有结合FcRn活性的肽段负载于铁蛋白纳米颗粒外表面，能够与人FcRn结合从而竞争性的阻遏IgG与FcRn的结合，达到治疗因IgG结合FcRn而导致的自发免疫性疾病的效果。与目前临床上开发的靶向FcRn的IgG药物相比，本公开的产品一方面通过融合铁蛋白亚基从而延长了阻遏肽的治疗半衰期；一方面，一个铁蛋白分子上能够具有结合FcRn活性的肽段，提供了多价的治疗方案，能大大提高结合FcRn的能力；再一方面，铁蛋白的EPR效应可使得该纳米药物相对富集在FcRn高表达的组织，从而有针对性的保护一些FcRn信号活跃的器官；再一方面，本公开构建的铁蛋白...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(1)具有结合FcRn活性的肽段；(2)重链铁蛋白单体亚基或其变体；所述(1)与(2)顺序连接，或所述(1)插入到(2)的序列中；任选地，所述(1)和(2)通过连接肽连接；优选地，所述具有结合FcRn活性的肽段的长度为10
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40个氨基酸；更优选地长度为15
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25个氨基酸；优选地，所述的具有结合FcRn活性的肽段来源于免疫球蛋白的Fc段，更优选地，来源于人IgG的Fc段。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述具有结合FcRn活性的肽段包含与SEQ ID NO.4或5所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；优选地，所述具有结合FcRn活性的肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或5所示；所述的重链铁蛋白单体亚基或其变体包含与SEQ ID NO.2、12、3或13所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、12、3或13所示；优选地，所述的具有结合FcRn活性的肽段插入到SEQ ID NO.2或12的第161位脯氨酸(P)和第162位谷氨酸(E)之间；优选地，所述的连接肽为(GGGGS)
n
，n＝2
‑
5、GSTSGSGKSSEGKG、GSGGGSG、GGGSGGSG；优选地，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO.6、7或8所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、7或8所示。3.一种纳米颗粒，其由至少一个权利要求1所述的融合蛋白和/或铁蛋白单体亚基或其变体自组装而形成，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示所述具有结合FcRn活性的肽段，所述具有结合FcRn活性的肽段能够结合FcRn；优选地，所述的铁蛋白单体亚基或其变体选自重链铁蛋白单体亚基或其变体、以及轻链铁蛋白单体亚基或其变体；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体，和/或轻链铁蛋白单体亚基或其变体与所述的融合蛋白形成纳米颗粒；更优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体是人重链铁蛋白单体亚基或其变体；优选地，所述轻链铁蛋白单体亚基或其变体是人轻链铁蛋白单体亚基或其变体；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体包含与SEQ ID NO.1、2、12、3或13所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述重链铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1、2、12、3或13所示；优选地，所述轻链铁蛋白单体亚基或其变体包含与SEQ ID NO.14、15、16或17所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述的轻链铁蛋白单体亚基或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.14、15、16或17所示；优选地，所述纳米颗粒为所述的融合蛋白和/或铁蛋白单体亚基或其变体自组装形成的24聚体；更优选地，所述纳米颗粒为24个融合蛋白自组装形成的24聚体；优选地，所述纳米颗粒与FcRn的结合活性为1
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3nM；更优选1.5
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2nM；更优选1.8nM。4.用于生产权利要求1或2所述的融合蛋白、或权利要求3所述的纳米颗粒的方法，所述方法包括将编码所述融合蛋白的一个或多个核酸分子导入细胞中，并在适合于表达编码的融合蛋白或形成纳米颗粒的条件下培养所述细胞。5.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3所述的纳米颗粒或根据权利要求4所述的方法生产的纳米颗粒；优选地，所述药物组合物是针对与FcRn靶点相关的疾病的药物；优选地，所述的疾病为抗体介导的病症、包括自身免疫性疾病、炎性疾病或高球蛋白血症；更优选地，所述抗体介导的病症为自身免疫性疾病，例如斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、阿尔茨海默病、抗嗜中性粒细胞胞质自身抗体(ANCA)、自身免疫性肾上腺疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、自身免疫性嗜中性粒细胞减少、自身免疫性卵巢炎、自体免疫性睾丸炎、自身免疫性荨麻疹、贝赫切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯尔曼综合征、腹型斯泼...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯天一，姚德惠，劳芳，刘岩，丁凤姣，张泽译，闫西冲，
申请(专利权)人：昆山新蕴达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：