用于检测肺结节良恶性的甲基化标志物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了用于检测肺结节良恶性的甲基化标志物及其应用。所述标志物包括序列为Seq ID No:1至Seq ID No:35所示序列或其完全互补序列中至少一个的片段、或所示序列及其上下游1kb序列在内的片段、所示序列的区域中的DNA甲基化位点、与所示序列具有至少90％以上序列同一性且与具有相同甲基化位点的变体或所示序列的区域中所覆盖的DNA甲基化单倍型及所述DNA甲基化单倍型的丰度。本发明专利技术基于肺结节良性和恶性样本的甲基化测序数据，筛选到甲基化水平在良性肺结节和恶性肺结节中存在明显差异的标志物,可以用于有效鉴别肺结节的良恶性，并且具有较高的灵敏度和特异性，适用于肺结节的早期鉴别与诊断。肺结节的早期鉴别与诊断。肺结节的早期鉴别与诊断。

【技术实现步骤摘要】
用于检测肺结节良恶性的甲基化标志物及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其是涉及用于检测肺结节良恶性的甲基化标志物及其应用。

技术介绍

[0002]肺癌是肺部恶性肿瘤，多起源于肺上皮细胞，是发生率和死亡率最高的癌症，其中大多数(约85％)为非小细胞肺癌(non
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small cell lung cancer，NSCLC)(Sun D等.2020)。尽管目前免疫治疗、靶向治疗等治疗手段显著提高了NSCLC患者生存率，但患者的预后依旧很差。NSCLC中晚期易发生转移，转移后患者五年生存率只有4.5％，而Ⅰ期原位癌患者五年生存率为55.6％(Weichert W等，2014)。遗憾的是，早期NSCLC患者无明显症状，超过80％的患者确诊为NSCLC时，已处于癌症中晚期，并伴随淋巴结扩散或远处转移，存活率较低。因此，开发行之有效的NSCLC早期诊断方法意义重大。
[0003]目前临床应用最广泛肺癌早期筛查措施为低剂量CT(LDCT)，LDCT能检测出早期NSCLC患者，降低20％肺癌死亡率(National Lung Screening Trial Research T等，2011)。LDCT具有较高敏感性(93.7％)，但其特异性较低。在LDCT检测中，Ⅰ期肺癌通常呈现为肺结节，其图像特征与良性肺结节无明显区别，无法从LDCT图像中精准区分良性和恶性肺结节，早期诊断的假阳性率达到96.4％。因此，LDCT早期诊断为肺结节的患者通常需要长时间随访进行多次LDCT复查，或者进行有创检测如抽吸物或手术样本活检进一步确诊，这些后续诊疗显著增加患者痛苦，并因为过度诊疗造成医疗资源浪费。
[0004]许多辅助检测手段可以提高肺结节诊断的准确性：Herder模型(AUC＝0.92)使用氟代脱氧葡萄糖正电子成像技术(FDG
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PET)辅助LDCT检测(Herder GJ等.2005)；Mayo模型(AUC＝0.83)根据肺结节大小、边缘、形态位置等图像特征和患者年龄、抽烟史、遗传病史等患者特征共同辅助评估等(Swensen SJ等，1997)。此外，许多分子生物学检测手段也逐渐应用在肺结节诊断中，如循环肿瘤细胞、癌症标志物检测等(Liu QX等，2021)。目前仍需开发更加有效、便捷、准确性更高的方法辅助肺结节诊断。
[0005]DNA甲基化与癌症的发生发展及诊断治疗有密切关系。良性肺结节和恶性肺结节具有不同的DNA甲基化特征，这些特征可用于肺结节诊断(Kerr KM等，2007)。液体活检指利用体液中的生物标志物进行非侵入性诊断的技术。目前研究已证实体液中(血液、尿液、肺泡灌洗液等)含有大量游离DNA(cfDNA)，这些游离DNA具有组织特异的DNA甲基化特征，可进行组织溯源和癌症检测(Lo YMD等，2021)。现cfDNA甲基化检测已应用至多种癌症检测中如结直肠癌、肝癌等，可在较高特异性下，灵敏地检测出早期癌症。已有一些文献发现cfDNA甲基化可应用于肺癌的早期诊断和筛查中(AUC＝0.90)(Liang N等，2021)，但其在肺结节良恶性诊断中表现很差(AUC＝0.72
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0.81)(Liang W等，2021)，因此，亟需寻找更为精准的液体活检甲基化生物标志物进行肺结节良恶性诊断。
[0006]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种用于检测肺结节良恶性的甲基化标志物及其应用。本专利技术利用检测血浆中甲基化标志物的甲基化水平可区分良性肺结节和恶性肺结节患者，实现更高准确率、更低成本的肺结节无创精准诊断的目的。
[0008]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
[0009]在一个方面，本专利技术提供了一种肺结节良恶性甲基化标志物，所述标志物包括如下标志物：
[0010](a1)、序列为Seq ID No:1至Seq ID No:35所示序列或其完全互补序列中至少一个的片段；
[0011](a2)、包含(a1)所述序列及其上下游1kb序列在内的片段；
[0012](a3)、(a1)或(a2)所示序列的区域中的DNA甲基化位点；
[0013](a4)、与(a1)或(a2)的序列具有至少90％以上序列同一性且与具有相同的甲基化位点的变体；或
[0014](a5)、(a1)或(a2)所示序列的区域中所覆盖的DNA甲基化单倍型及所述DNA甲基化单倍型的丰度。
[0015]在一个实施方案中，肺结节良恶性甲基化标志物包括选自以下序列中的一个或多个或全部，或者以下序列的互补序列中的一个或多个：Seq ID No：1、Seq ID No：2、Seq ID No：3、Seq ID No：4、Seq ID No：5、Seq ID No：6、Seq ID No：7、Seq ID No：8、Seq ID No：9、Seq ID No：10、Seq ID No：11、Seq ID No：12、Seq ID No：13、Seq ID No：14、Seq ID No：15、Seq ID No：16、Seq ID No：17、Seq ID No：18、Seq ID No：19、Seq ID No：20、Seq ID No：21、Seq ID No：22、Seq ID No：23、Seq ID No：24、Seq ID No：25、Seq ID No：26、Seq ID No：27、Seq ID No：28、Seq ID No：29、Seq ID No：30、Seq ID No：31、Seq ID No：32、Seq ID No：33、Seq ID No：34和Seq ID No：35。所述序列在基因组中的位置分别为：chr1:119527250
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119527450、chr2:19556785
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19556985、chr2:71115853
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71116351、chr2:176936260
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176936480、chr2:176945337
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176945719、chr2:176956558
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176956758、chr2:176969332
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176969729、chr2:223163219
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223163595、chr3:50377975
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50378564、chr3:157812131
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157812482、chr5:1876269
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1876469、chr5:3599720
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3599934、chr5:3602162
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3602362、chr5:115152406
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115152637、chr6:85476974
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85477296、chr6:137814694
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137814894、chr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测肺结节良恶性的甲基化标志物，其特征在于，所述甲基化标志物包括如下标志物：(a1)、序列为Seq ID No:1至Seq ID No:35所示序列或其完全互补序列中至少一个的片段；(a2)、包含(a1)所述序列及其上下游1kb序列在内的片段；(a3)、(a1)或(a2)所示序列的区域中的DNA甲基化位点；(a4)、与(a1)或(a2)的序列具有至少90％以上序列同一性且与具有相同的甲基化位点的变体；或(a5)、(a1)或(a2)所示序列的区域中所覆盖的DNA甲基化单倍型及所述DNA甲基化单倍型的丰度。2.用于检测权利要求1所述的甲基化标志物的引物或探针，其特征在于，所述引物以所述甲基化标志物所在的核苷酸序列为靶序列，用于靶序列的特异性扩增；所述探针特异性捕获所述甲基化标志物所在的核苷酸序列。3.一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有用于检测如权利要求1所述的肺结节良恶性甲基化标志物的试剂。4.检测权利要求1所述的肺结节良恶性甲基化标志物的甲基化水平的试剂在制备用于鉴定样品中肺结节良恶性诊断试剂盒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测试剂还包括在采用PCR扩增法、荧光定量PCR法、数字PCR法、液相芯片法、二代测序法、三代测序法、亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法、甲基化芯片法中任一种或其组合中所使用的试剂。6.一种肺结节良恶性预测评估模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)收集肺结节良性样本和恶性样本，分为训练集和测试集；(b)提取样本的cfDNA，进行建库、测序；(c)对序列进行甲基化转化处理、数据比对，计算样本的AMF和MHF值；(d)对样...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙津，李威，马成城，徐敏杰，苏志熙，刘蕊，
申请(专利权)人：江苏鹍远生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：