用于生产低聚糖的具有降低的乳糖内化的微生物细胞制造技术

本申请公开了用于生产目标低聚糖的遗传工程化的微生物细胞以及用所述遗传工程化的微生物细胞生产低聚糖的方法，其中所述微生物细胞具有大肠杆菌乳糖通透酶LacY的变体，该变体表现出降低的乳糖转运活性。体表现出降低的乳糖转运活性。体表现出降低的乳糖转运活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产低聚糖的具有降低的乳糖内化的微生物细胞
[0001]本专利技术涉及微生物细胞对乳糖的内化。更具体地说，本专利技术涉及乳糖杀伤(lactose killing)的现象，并提供了用于减少或减轻微生物细胞乳糖杀伤的手段和方法。本专利技术还涉及在低聚糖和糖缀合物的生产中使用抗乳糖杀伤的微生物细胞的优势。

技术介绍

[0002]碳水化合物(也称为糖类)是分为以下四个化学组的生物分子：单糖，二糖，低聚糖和多糖。碳水化合物可以游离形式或糖缀合物形式存在，当与蛋白质或多肽连接时称为糖蛋白，或与脂质连接时称为糖脂。碳水化合物的另一种分类是基于它们的生理作用。为人体提供单糖的碳水化合物被定义为“可消化的”碳水化合物，其中“不可消化的”碳水化合物在人体小肠内耐消化。
[0003]低聚糖构成了碳水化合物中一组不同的分子。如本文所用的，术语“低聚糖”通常指由至少三个单糖部分，但不超过12个单糖部分，优选不超过10个单糖部分组成的聚合糖分子，单糖部分以糖苷键相互连接。低聚糖可由直链的单糖部分组成，或者可以是支链分子，其中至少一个单糖部分具有至少三个通过糖苷键与其结合的单糖部分。低聚糖的单糖部分可以选自醛糖(例如：阿拉伯糖，木糖，核糖，脱氧核糖，来苏糖，葡萄糖，艾杜糖，半乳糖，塔罗糖，阿洛糖，阿卓糖，甘露糖)，酮糖(例如：核酮糖，木酮糖，果糖，山梨糖，塔格糖)，脱氧糖(例如鼠李糖，岩藻糖，奎诺糖)，脱氧氨基糖(例如：N
‑
乙酰基葡萄糖胺，N
‑
乙酰基甘露糖胺，N
‑
乙酰基半乳糖胺)，糖醛酸(例如：半乳糖醛酸葡萄糖醛酸)和酮糖酸(例如N
‑
乙酰神经氨酸)。
[0004]具有被双歧杆菌和/或乳酸杆菌选择性代谢的能力的不可消化的低聚糖被称为益生元。食用益生元低聚糖的好处包括缓解便秘，降低患结肠癌的风险，抑制胃肠道的病原体，增加矿物质吸收，调节免疫系统，产生短链脂肪酸和维生素，减少血液胆固醇和脂质的水平，以及改善肠道中的微生物平衡。一组特定的益生元低聚糖便是所谓的“人乳低聚糖”(HMO)。
[0005]人乳低聚糖构成了一种人乳中存在的不可消化的低聚糖的复杂混合物。人乳在其低聚糖含量和组成方面是独一无二的。迄今为止，已经确定了150多种结构上不同的HMO。绝大多数HMO的特征在于在其还原端的乳糖部分。许多HMO在其非还原端中含有岩藻糖部分和/或唾液酸部分。更一般地说，作为HMO来源的单糖是D
‑
葡萄糖、D
‑
半乳糖、N
‑
乙酰基葡萄糖胺、L
‑
岩藻糖和N
‑
乙酰基神经氨酸。
[0006]益生元低聚糖可以从天然来源(如菊苣和朝鲜蓟)获得，或者它们可以通过化学合成或体外酶促合成产生。对于低聚糖(尤其是一些HMO)的工业规模生产，开发了发酵方法，其中通过遗传工程化的微生物细胞生产目标低聚糖，因为HMO很难从它们的天然来源获得。单个HMO的工业规模发酵生产，使这些益生元化合物可用于食品行业，从而使得HMO可以作为婴儿配方物的补充物。
[0007]在低聚糖的发酵生产中，即：在生产目标低聚糖(尤其是HMO)的生产中，遗传工程
化的细菌通常是在存在(i)外源性碳源和(ii)外源性乳糖的情况下培养。本文所用的术语“外源性”是指在培养遗传工程化的细菌用于生产目标低聚糖之前和/或期间存在于和/或添加到遗传工程化的细菌的培养基中的化合物。通常，将该化合物本身添加到培养基中，但是在其它实施方案中，该化合物也可以由存在于和/或已添加到培养基中的微生物细胞产生。乳糖构成HMO还原端的二糖部分，并且通常是遗传工程化的细菌胞内合成单个HMO的起始分子。
[0008]乳糖(β
‑
D
‑
半乳吡喃糖基
‑
(1
→
4)
‑
D
‑
葡萄糖(β
‑
D
‑
galactopyranosyl
‑
(1
→
4)
‑
D
‑
glucose))是一种在乳制品动物(dairy animal)乳中发现的天然存在的糖。乳糖是由葡萄糖部分和半乳糖部分组成的二糖。婴儿哺乳动物由其母亲哺乳以喝富含乳糖的乳。在婴儿的肠道中，乳糖酶(β
‑
D
‑
半乳糖苷酶，β
‑
D
‑
galactosidase)将乳糖水解为其组分：可以被吸收的单糖葡萄糖和半乳糖。许多肠道细菌，包括大肠杆菌(Escherichia coli)，更喜欢以葡萄糖作为碳源，并且如果不能获得葡萄糖，则可以有效地消化乳糖。
[0009]为了通过微生物细胞胞内合成在其还原端带有乳糖部分的目标低聚糖，需要建立细胞内乳糖池，使得乳糖不被或不被过度降解为其单糖，而是可用于所述低聚糖的生物合成。提供细胞内乳糖池的一种选择是缺失或功能性失活编码降解或转化乳糖的酶的细菌的内源基因。示例性的基因为大肠杆菌中的lacZ和/或lacA。lacZ基因编码水解乳糖的β
‑
半乳糖苷酶(LacZ)，而lacA编码β
‑
半乳糖苷转乙酰基酶(LacA)——一种将乙酰基团从乙酰基
‑
CoA转移至β
‑
半乳糖苷的酶。
[0010]然而，增加微生物细胞中细胞内乳糖池也存在缺点。一个这种缺点是一种称为乳糖杀伤(lactose killing)的现象。乳糖杀伤是一种特殊的现象，其中当大肠杆菌细菌被从乳糖限制的生长培养基转移到含乳糖的生长培养基时，因乳糖穿过细菌细胞膜的快速内化，绝大多数大肠杆菌细菌会死亡。乳糖杀伤的现象与在其还原端带有乳糖部分的低聚糖(例如HMO)的发酵生产特别相关，所示发酵生产使用其中当将微生物细胞接种到所述发酵培养基中和/或在发酵过程中连续地或以至少一次推注(bolus)向发酵培养基中加入乳糖时，无论发酵培养基是否含有乳糖，均向发酵培养基中提供大量外源乳糖。由于当给发酵培养基提供乳糖时，乳糖杀伤至少会延迟发酵罐中微生物细胞培养物的生长和生产率，因此希望使用对乳糖杀伤具有抗性的微生物细胞来发酵生产目标低聚糖或糖缀合物。
[0011]在尝试克服特定产品的微生物生产中的乳糖杀伤的缺点时，WO 2016/075243A1建议通过以下方式使微生物抵抗乳糖杀伤：改变微生物中乳糖转运蛋白的表达，使得所述乳糖转运蛋白的表达水平导致耐受乳糖挑战并保留用所述乳糖转运蛋白的野生型表达盒获得的乳糖流入量的至少50％的微生物。
[0012]然而，细菌细胞中乳糖通透酶如LacY的表达水平降低，可能影响细菌细胞的生长，因为已知乳糖通透酶与磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的III
GLc
酶(enzyme III
Glc
)相互作用，磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的III
GLc
酶也参与调节bgl操纵子和其它非P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于生产目标低聚糖的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞包含用于内化外源乳糖的乳糖通透酶，其中所述乳糖通透酶是大肠杆菌乳糖通透酶LacY的变体，与大肠杆菌野生型LacY相比，所述变体表现出降低的乳糖内化。2.根据权利要求1所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述大肠杆菌乳糖通透酶LacY的变体与大肠杆菌野生型乳糖通透酶LacY具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的序列同一性。3.根据权利要求1或2所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述大肠杆菌乳糖通透酶LacY的变体在相对于如SEQ ID No.1所示的乳糖通透酶的氨基酸位置第292、293和293位的至少一个氨基酸位置中包含碱性氨基酸残基。4.根据权利要求3所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述碱性氨基酸残基选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。5.根据权利要求1至4中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞包含含有以下核苷酸序列的核酸分子：a)编码如权利要求1至4中任一项所限定的大肠杆菌野生型乳糖通透酶LacY的变体的核苷酸序列；b)与a)的任一个核苷酸序列互补的核苷酸序列；c)在严格的条件下，与a)或b)中所述的任一个核苷酸序列杂交的核苷酸序列。6.根据权利要求5所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述编码大肠杆菌野生型乳糖通透酶LacY的变体的核苷酸序列与表达控制序列可操作地连接。7.根据权利要求1至6中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞还包含：
‑
至少一种用于的胞内生物合成的代谢途径；和
‑
至少一种糖基转移酶，用于在细胞内将单糖部分从作为供体底物的核苷酸活化的单糖转移至作为受体分子的乳糖或低聚糖。8.根据权利要求1至7中任一项所述的遗传工程化的微生物细胞用于生产目标低聚糖的用途，其中所述目标低聚糖在其还原端包含乳糖部分。9.一种用于生产目标低聚糖的方法，其中所述目标低聚糖是在微生物细胞中合成，所述方法包括：
‑
提供用于如权利要求1至7中任一项所限定的低聚糖的胞内生物合成的遗传工程化的微生物细胞；
‑
在培养基中在存在外源乳糖的情况下，及在允许细胞胞内合成目标低聚糖的条件下培养所述遗传工程化的细胞；和
‑
从培养基或细胞中回收目标低聚糖。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述低聚糖选自：2
’‑
岩藻糖基乳糖(2'
‑
FL)，3
‑
岩藻糖基乳糖(3
‑
FL)，2',3
‑
二岩藻糖基乳糖(DFL)，乳
‑
N
‑
三糖II，乳
‑
N
‑
四糖(LNT)，乳
‑
N
‑
新四糖(LNnT)，乳
‑
N
‑
岩藻戊糖I(LNFP
‑
I)，乳
‑
N
‑
新岩藻戊糖I(LNnFP
‑
I)，乳
‑
N
‑
岩藻戊糖II(LNFP
‑
II)，乳
‑
N
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岩藻戊糖III(LNFP
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III)，乳
‑
N
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岩藻戊糖V(LNFP
‑
V)，乳
‑
N
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：科汉森母乳低聚糖股份有限公司，
类型：发明
国别省市：