用于增加胶原蛋白产量的工程化细胞制造技术

用于增加胶原蛋白产量的细胞通过一种新的CRISPR细胞工程化方法工程化。所述方法可以使用人细胞或甚至从患者体内收集的细胞进行。与非人类细胞产生的胶原蛋白相比，所述细胞产生的胶原蛋白植入人类患者时具有较低的免疫原性风险。还提供了包括化学添加剂的细胞培养基以对胶原蛋白产量产生进一步的正向效应。基以对胶原蛋白产量产生进一步的正向效应。基以对胶原蛋白产量产生进一步的正向效应。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增加胶原蛋白产量的工程化细胞
[0001]交叉引用
[0002]本申请要求2020年10月15日提交的，序列号为63/092,433的美国临时申请的优先权，所述申请通过引用全部并入本文。
[0003]联邦资助声明
‑
研究或开发
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的资助号为EY029167的政府支持下完成的。政府对本专利技术具有一定的权利。

技术介绍

[0005]平均而言，美国每年发生3300万例肌肉骨骼损伤，其中50％的损伤涉及肌腱和韧带(如肩袖、前交叉韧带)，并且是由于创伤或退化造成(Wu等人，2017年)。肌腱和韧带是基于胶原蛋白的软组织，受伤后往往无法有效愈合。此外，这些肌腱和韧带损伤的平均报告恢复时间为12周，受损肌腱可能永远不会完全恢复到损伤前状态(nhs.uk/conditions/hand
‑
tendonrepair/recovery/)。为了加快这一漫长的恢复时间，正在开发治疗方法，包括在手术修复这些受损软组织后植入I型胶原蛋白补片。手术补片有助于弥合肌腱末端之间的间隙，避免拉伸受伤组织，使其保持强壮并防止再损伤(orthocarolina.com/media/how
‑
does
‑
a
‑
patch
‑
repair
‑
a
‑
rotator
‑
cuff
‑
tear)。即使在这些手术干预之后，患者的力量或活动能力通常也不会恢复到受伤前的状态。目前，这些补片的I型胶原蛋白源自动物，因此，当植入人类患者时，此类治疗具有显著的免疫系统排斥风险(Vig等人，2019)。一个实例是胶原蛋白修复补片，用于加强肩袖修复。所述补片由源自猪真皮的脱细胞胶原蛋白组成(Yao等人，2005年)。所述补片已显示出优于其他生物材料骨架的前景，但其机械性能不足以修复肌腱或韧带，且用于灭菌和净化补片的制造工艺破坏了胶原蛋白结构(Okeefe等人，2013年)。需要改善胶原蛋白的来源，用于人类患者的组织修复和重建。

技术实现思路

[0006]本技术提供了能够大大提高胶原蛋白产量的工程化细胞，包括人类细胞，以及使用它们获得胶原蛋白的方法，所述胶原蛋白用于治疗疾病且不存在不期望的免疫应答风险。使用本方法，可以从需要胶原蛋白补充剂治疗疾病的患者中获得细胞，然后将其工程化用于产生大量患者自己的胶原蛋白以用于植入，包括自体末端胶原蛋白、自体前原蛋白或自体去端肽胶原蛋白。此外，所述方法可用于同一物种(如人类供体细胞)以产生异体末端胶原蛋白、异体前胶原蛋白或异体去端肽胶原蛋白。细胞工程化过程通过使用CRISPR的基因工程克服胶原蛋白合成途径中的瓶颈，并在细胞生长培养基中任选使用化学添加剂，以刺激胶原蛋白合成中的翻译和转录后修饰。可以使用CRISPR激活(CRISPRa)对角膜成纤维细胞等人类细胞进行基因修饰，以增加一种或多种基因的表达，所述基因用于负责胶原蛋白(包括I型胶原蛋白)的转录、翻译和翻译后加工。所述胶原蛋白可用于，例如，软组织修复的胶原蛋白补片，并可以以当前人类胶原蛋白市场的少量成本生产。此外，本方法提供的胶原蛋白，因为不需要胃蛋白酶提取从而缺乏端肽损伤。由于胶原蛋白可能来自人类来源或
来自需要用所述胶原蛋白治疗的患者的细胞，因此需要更少的筛选和纯化步骤。
[0007]所述技术的一个方面是能够增强胶原蛋白生物合成的工程化细胞。所述细胞被工程化用于对细胞胶原蛋白生物合成相关的靶基因执行基于CRISPR的激活(CRISPRa)。作为用CRISPRa系统成分转染或转导的结果，细胞表达与转录激活蛋白(dCas9激活剂)融合的核酸内切酶缺陷型Cas9(dCas9)蛋白，并表达对靶基因特异的向导RNA(gRNA)。与相同类型的未工程化细胞相比，所述工程化细胞能够增加胶原蛋白生物合成。作为CRISPRa工程化的结果，细胞的胶原蛋白生物合成率增加，例如，至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍或至少300倍。细胞优选为天然产生所需类型的胶原蛋白的细胞，所述胶原蛋白的生物合成由工程化细胞中的CRISPRa激活。举例来说，所述细胞可以选自任何所需组织或器官的成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、周细胞、造血细胞和纤维细胞。
[0008]在所述技术的另一个方面，上述工程化细胞已使用CRISPRa工程化，以增加一种或多种基因的表达，所述一种或多种基因选自COL1A1、COL1A2、TGF
‑
β1、TGF
‑
β2、TGF
‑
β3、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。优选地，所述细胞被工程化以在同一细胞中增加这些基因中2种、3种、4种、5种或更多种的表达。例如，所述细胞可以表达gRNA分子，包括SEQ ID NO:1
‑
156中任一条或多条的核苷酸序列。
[0009]在所述技术的另一个方面，所述工程化细胞已被工程化用于执行对一种或多种靶向基因的CRISPRa，所述一种或多种靶向基因选自脯氨酰
‑3‑
羟化酶家族基因、脯氨酰
‑4‑
羟化酶家族基因、赖氨酰羟化酶家族基因、GLT25D1、GLT25D2、Grp78、Grp94、蛋白二硫键异构酶(PDI)家族基因、钙网蛋白、钙连蛋白、亲环素B、肽基脯氨酰顺反异构酶(PPlase)家族基因、亲环素、FK 506结合蛋白(FKBP)基因、亲环素B(CypB)、HSP47、TANG01、SEC13、SEC31和迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)。这些基因表达的增加有助于工程化细胞翻译后加工或分泌胶原蛋白到培养基中。
[0010]在所述技术的另一个方面，所述工程化细胞通过CRISPRa被工程化，以增加一种或多种胶原蛋白基因和一种或多种TGFβ基因的表达。优选地，所述细胞还被工程化为增加一种或多种前肽酶基因的表达。每个激活基因的表达可能会增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍或至少300倍。与细胞中的其他激活基因相比，每个单独的激活基因可以以不同程度或相似程度被激活。
[0011]关于上述技术方面，所述细胞优选地被本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种能够增强胶原蛋白生物合成的工程化细胞，其中所述细胞被工程化以通过所述细胞对与胶原蛋白生物合成相关的靶基因进行基于CRISPR的激活(CRISPRa)，其中所述细胞表达与转录激活蛋白(dCas9激活剂)融合的内切酶缺陷Cas9(dCas9)蛋白和对靶基因特异的向导RNA(gRNA)，其中与同一类型的未工程化细胞相比，所述工程化细胞能够增加胶原蛋白生物合成的至少10倍，至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍或至少300倍。2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述靶基因选自COL1A1、COL1A2、TGF
‑
β1、TGF
‑
β2、TGF
‑
β3、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。3.根据权利要求2所述的工程化细胞，其中由所述细胞表达并对所述靶基因特异的gRNA包括SEQ ID NO:1
‑
156中任一条的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞被工程化为执行一种或多种靶基因的CRISPRa，所述一种或多种靶基因选自脯氨酰
‑3‑
羟化酶家族基因、脯氨酰
‑4‑
羟化酶家族基因、赖氨酰羟化酶家族基因、GLT25D1、GLT25D2、Grp78、Grp94、蛋白二硫键异构酶(PDI)家族基因、钙网蛋白、钙连蛋白、亲环素B、肽基脯氨酰顺反异构酶(PPlase)家族基因、亲环素、FK 506结合蛋白(FKBP)基因、亲环素B(CypB)、HSP47、TANG01、SEC13、SEC31和迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)。5.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞表达对两种或多种靶基因特异的gRNA，并且所述两种或多种靶基因中的每一种都被激活。6.根据权利要求5所述的工程化细胞，其中一种或多种胶原蛋白基因和一种或多种TGFβ基因被靶向；其中所述一种或多种胶原基因选自COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2和COL5A3；其中所述一种或多种TGF
‑
β基因选自TGF
‑
β1、TGF
‑
β2和TGF
‑
β3；和其中所述细胞表达对所述一种或多种胶原蛋白基因和所述一种或多种TGF
‑
β基因特异的gRNA。7.根据权利要求6所述的工程化细胞，其中所述胶原基因选自COL1A1和COL1A2；所述TGF
‑
β基因选自TGF
‑
β1和TGF
‑
β3，其中所述COL1A1 gRNA包括SEQ ID NO:1
‑
4中任一条的核苷酸序列，COL1A2 gRNA包括SEQ ID NO:5
‑
8中任一条的核苷酸序列，其中所述TGF
‑
β1gRNA包括SEQ ID NO:13
‑
16中任一条的核苷酸序列，TGF
‑
β3gRNA包括SEQ ID NO:9
‑
12中任一条的核苷酸序列。8.根据权利要求6所述的工程化细胞，其中一种或多种前肽酶基因被进一步靶向，其中所述前肽酶基因选自ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。9.根据权利要求8所述的工程化细胞，其中所述前肽酶基因ADAMTS2和BMP
‑
1被靶向，其中ADAMTS2 gRNA包括SEQ ID NO:69
‑
72中任一条的核苷酸序列，并且所述BMP
‑
1gRNA包括
SEQ ID NO:153
‑
156中任一条的核苷酸序列。10.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述转录激活剂选自VP64、p65、Rta、VPR(VP64、p65和Rta的组合)、MS2、HSF1、SAM(MS2、p65和HSF
‑
1的组合)和SunTag。11.根据权利要求10所述的工程化细胞，其中所述dCas9激活剂为dCas9
‑
VPR。12.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞被转染以表达所述dCas9激活剂和所述一种或多种gRNA。13.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞已被转导以表达所述dCas9激活剂和所述一种或多种gRNA。14.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞是源自选自成纤维细胞、间充质细胞、肌成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞和诱导多能干细胞的细胞类型。15.根据权利要求14所述的工程化细胞，其中所述细胞源自人角膜成纤维细胞。16.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞源自从哺乳动物受试者获得的细胞，所述哺乳动物受试者需要施用胶原蛋白。17.一种细胞培养物，包括权利要求1所述的工程化细胞。18.根据权利要求17所述的细胞培养物，所述细胞培养物是永生的。19.一种用于工程化细胞以提供增强的胶原蛋白生物合成的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供细胞、编码dCas9激活剂的第一核酸分子和对与胶原蛋白生物合成相关的靶基因特异的第二核酸分子；和(b)用所述第一核酸分子和第二核酸分子转染或转导所述细胞；所述细胞变得能够表达所述dCas9激活剂和所述gRNA，所述靶基因被激活。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶基因选自COL1A1、COL1A2、TGF
‑
β1、TGF
‑
β2、TGF
‑
β3、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述gRNA包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:156中任一条的核苷酸序列。22.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞被工程化为执行一种或多种靶向基因的CRISPRa，所述一种或多种靶向基因选自脯氨酰
‑3‑
羟化酶家族基因、脯氨酰
‑4‑
羟化酶家族基因、赖氨酰羟化酶家族基因、GLT25D1、GLT25D2、Grp78、Grp94、蛋白二硫键异构酶(PDI)家族基因、钙网蛋白、钙连蛋白、亲环素B、肽基脯氨酰顺反异构酶(PPlase)家族基因、亲环素、FK 506结合蛋白(FKBP)基因、亲环素B(CypB)、HSP47、TANG01、SEC13、SEC31和迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)。23.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞用两个或多个第二核酸分子转染，每个第二核酸分子对不同的靶基因特异，其中每个所述靶基因被激活。24.根据权利要求23所述的方法，其中一种或多种胶原蛋白基因和一种或多种TGFβ基因被靶向；其中一种或多种胶原蛋白基因选自COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、
COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2和COL5A3；其中，所述TGF
‑
β基因选自TGF
‑
β1、TGF
‑
β2和TGF
‑
β3；以及其中所述细胞表达对所述一种或多种胶原蛋白基因和所述一种或多种TGF
‑
β基因特异的gRNA。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述胶原蛋白基因选自COL1A1和COL1A2，所述TGF
‑
β基因选自TGF
‑
β1和TGF
‑
β3，其中COL1A1 gRNA包括SEQ ID NO:1
‑
4中任一条的核苷酸序列，COL1A2 gRNA包括SEQ ID NO:5
‑
8中任一条的核苷酸序列，TGF

【专利技术属性】
技术研发人员：蒂姆，
申请(专利权)人：东北大学，
类型：发明
国别省市：