一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺，涉及生物技术领域。该生产工艺包括以下步骤：对裂解液进行澄清过滤和浓缩换液，得到浓缩液；对所述浓缩液进行羟基磷灰石层析，得到超螺旋质粒洗脱液；对所述超螺旋质粒洗脱液进行终浓缩处理，即得目的质粒；所述裂解液是菌体原料经碱裂解和中和处理后所得到；所述浓缩液中含有100

【技术实现步骤摘要】
一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺。

技术介绍

[0002]碱性裂解法是DNA提取成本最低、所需时间最短的方法。所谓碱性裂解提取法，即在强碱作用下，快速破坏蛋白质的一级结构，正因为强碱对蛋白质有强烈的变性乃至裂解作用，所以，检材在强碱性PH条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞及核膜，使核酸酶变性及DNA释放。但是现有的碱性裂解法也存在一些不足之处，例如大量生产质粒，在经破碎重悬、裂解、中和后，样品体积会呈2倍
‑
3倍的增加，为后续纯化增加工作时间。例如：200g菌，经过重悬（10:1）、裂解（1:1）和中和（1:1），体积就达到了5500mL，为后续层析步骤增加很多工作量。因此碱裂解的步骤所产生的大体积的溶液，需要澄清和浓缩的步骤缩小体积，再配合传统工艺的三步法（图1）层析纯化质粒。常用的澄清方法是离心或者添加絮凝剂（如：硫酸铵沉淀，CaCl2沉淀等），也有添加NH4HCO3或NaHCO3的，使之自然分层，但结果往往是操作繁琐，容易产生污染，难以工艺放大，工艺验证困难，成本高昂。传统三步法中使用Sepharose 6 FF分子筛层析，可收获质粒DNA，去除RNA、蛋白等大量杂质，分辨率高，但通量只能做到柱体积的0.3 CV，而且对柱效的要求极高，还需要衔接Capto PlasmidSelect进行开环质粒的去除和Capto Q ImpRes内毒素、宿主蛋白及宿主核酸的去除，如果需要处理大体积菌液，需要填装大体积层析柱或者分多批次进行层析，直接导致不易操作或者步骤繁琐。
[0003]目前，有改良后的两步层析法（图2），使用复合层析填料（Core 700+疏水层析）代替三步法中的分子筛和阴离子交换层析进行质粒的生产纯化，Capto Core 700为复合模式层析填料，质粒DNA等大分子不能通过其惰性外壳的孔进入核内，经过外水直接流穿，而较小杂质如RNA片段、蛋白质与内毒素片段等经过小孔进入内核，与核内的辛胺基团结合，达到分离的目的，再配合PlasmidSelect Xtra嗜硫亲和层析，来分离ocDNA（开环质粒）和scDNA（超螺旋质粒），提高质粒的均一性。虽然两步法使层析步骤减少，提高了纯化效率，但是回收率一般，只有75%左右，造成回收率损失较大。为进一步提高纯化收率和生产效率，有必要继续对质粒生产工艺进行优化。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺，以解决上述现有技术存在的问题，利用该生产工艺进行质粒生产，可以有效提升质粒的回收率和生产效率。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺，包括以下步骤：对裂解液进行澄清过滤和浓缩换液，得到浓缩液；
对所述浓缩液进行羟基磷灰石层析，得到超螺旋质粒洗脱液；对所述超螺旋质粒洗脱液进行终浓缩处理，即得目的质粒；所述裂解液是菌体原料经碱裂解和中和处理后所得到；所述浓缩液中含有100
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250mM NaCl；所述羟基磷灰石层析采用的洗脱液包括0.5M NaCl。
[0006]进一步地，所述澄清过滤包括离心和中空纤维柱过滤处理；所述中空纤维柱为0.5μm中空纤维柱。
[0007]进一步地，所述中空纤维柱过滤处理的流速为1200mL/min，压力为3
‑
8Psi。
[0008]进一步地，所述浓缩换液采用300KD中空纤维柱。
[0009]进一步地，所述浓缩换液的流速为420mL/min，压力为3
‑
8Ps。
[0010]进一步地，所述浓缩换液采用平衡液进行溶液置换，所述平衡液包括100mM Tris
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HCl和150mM NaCl。
[0011]进一步地，所述羟基磷灰石层析包括平衡、上样、再平衡和洗脱处理；所述平衡、所述上样、所述再平衡和所述洗脱的流速均为15mL/min。
[0012]进一步地，所述终浓缩采用30KD中空纤维柱。
[0013]进一步地，所述终浓缩的流速为50mL/min，压力为3
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5Psi。
[0014]本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术使用羟基磷灰石层析的方法进行层析，在浓缩换液后，使浓缩液保持一定的氯化钠浓度，使开环质粒和一些相关杂质不易与羟基磷灰石填料进行结合，直接流穿，然后经过含有高浓度氯化钠的洗脱液的洗脱，即可得到较高质量的超螺旋质粒。
[0015]本专利技术不需要额外的增加凝胶过滤或者疏水层析的步骤，即可使杂质流穿，然后一步洗脱即得目的质粒，回收率达到95%以上，大大提高了质粒的生产效率。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017]图1为三步法纯化质粒的工艺流程图；图2为两步法纯化质粒的工艺流程图；图3为本专利技术质粒生产工艺的工艺流程图；图4为羟基磷灰石CHT层析的图谱；图5为实施例1中羟基磷灰石CHT层析步骤的酶切验证结果；其中，M：Mark；1：原菌液；2：流穿杂质；3：目的质粒；图6为对比例1中Core 700层析的图谱；图7为对比例1中PlasmidSelect Xtra层析的图谱；图8为对比例1中PlasmidSelect Xtra层析步骤的酶切验证结果；其中，1：原菌液；2：core700层析后（除去RNA）；3：原质粒（Core 700层析后）；4：洗杂（开环质粒）；5：亲和流穿；6：目的质粒；
图9为对比例2中Sepharose 6 FF层析的图谱；图10为对比例2中Sepharose 6 FF层析步骤的酶切验证结果；其中，1：原质粒（未过6FF层析）；2：经过6FF层析后（去除RNA）。
[0018]图11为对比例2中PlasmidSelect Xtra层析的图谱；图12为对比例2中PlasmidSelect Xtra层析步骤的酶切验证结果；图13为对比例2中Capto Q ImpRes层析的图谱。
具体实施方式
[0019]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0020]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0021]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：对裂解液进行澄清过滤和浓缩换液，得到浓缩液；对所述浓缩液进行羟基磷灰石层析，得到超螺旋质粒洗脱液；对所述超螺旋质粒洗脱液进行终浓缩处理，即得目的质粒；所述裂解液是菌体原料经碱裂解和中和处理后所得到；所述浓缩液中含有100
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250mM NaCl；所述羟基磷灰石层析采用的洗脱液包括0.5M NaCl。2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述澄清过滤包括离心和中空纤维柱过滤处理；所述中空纤维柱为0.5μm中空纤维柱。3.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于，所述中空纤维柱过滤处理的流速为1200mL/min，压力为3
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8Psi。4.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述浓缩换...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红，侯国栋，胡国健，刘国庆，李蓓蓓，
申请(专利权)人：赛奥斯博生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：