一种牛病毒性腹泻病毒的mRNA疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种牛病毒性腹泻病毒的mRNA疫苗及其应用，属于核酸疫苗技术领域。为了提高牛病毒性腹泻病毒mRNA疫苗的免疫保护作用。本发明专利技术提供一种牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea Virus）的mRNA疫苗，所述mRNA疫苗编码牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白或牛病毒性腹泻病毒截短E2蛋白。实现了对牛病毒性腹泻病毒的免疫效果的提升。病毒的免疫效果的提升。病毒的免疫效果的提升。

【技术实现步骤摘要】
一种牛病毒性腹泻病毒的mRNA疫苗及其应用


[0001]本专利技术属于病毒疫苗
，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒的mRNA疫苗及其应用。

技术介绍

[0002]牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV）可感染牛引起病毒性腹泻——急性、热性、接触性传染病。BVDV呈世界性分布，感染情况复杂，隐性感染率极高。据估计，其导致的生产损失达687.8美元/头，给全球养牛业造成了巨大损失。BVDV可引起牛生长缓慢、繁殖紊乱、产能降低等多种症状。妊娠50~150天母畜感染后病毒可通过胎盘垂直传播至胎儿，此时由于胎儿免疫系统尚未发育完全，未能识别BVDV而引起免疫耐受，出生后即成为BVDV持续感染牛，且终生带毒，并通过鼻涕、唾液、精液等不断向外界排毒，成为畜群重要的传染源。此病给全球养殖业造成经济损失与生物安全问题，危害巨大。目前使用的国外使用的BVDV疫苗主要包括改良性减毒活疫苗、灭活疫苗、E2亚单位疫苗。在美国，BVDV疫苗主要与牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒等组成多联传统疫苗进行应用。国内商品化BVDV疫苗仅为灭活疫苗，种类单一；可分为BVDV单联灭活疫苗与BVDV、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗。
[0003]亚单位疫苗与灭活疫苗存在共有缺点，即需要佐剂，并且需多次免疫，在单剂至抗体水平达到峰值间往往存在免疫空白易感期，且亚单位疫苗存在无法保持天然免疫原构象等缺点。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了提高牛病毒性腹泻病毒mRNA疫苗的免疫保护作用。
[0005]本专利技术提供一种牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea Virus）的mRNA疫苗，所述mRNA疫苗编码牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白或牛病毒性腹泻病毒截短E2蛋白。
[0006]进一步地限定，牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白的序列如SEQ ID NO.9所示；牛病毒性腹泻病毒截短E2蛋白的序列如SEQ ID NO.10所示。
[0007]进一步地限定，mRNA疫苗由以下成分组成：5
’
端非翻译区、信号肽序列、牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白的编码RNA基因或牛病毒性腹泻病毒截短E2蛋白的的编码RNA基因、3
’
端非翻译区和多聚腺苷酸。
[0008]进一步地限定，5
’
端非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；3
’
端非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；多聚腺苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白的编码RNA基因序列如SEQ ID NO.15所示；牛病毒性腹泻病毒截短E2蛋白的编码RNA基因序列如SEQ ID NO.16所示。
[0009]本专利技术提供牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白的序列或牛病毒性腹泻病毒截短E2蛋白的序列在制备预防或治疗牛呼吸道疾病综合征的mRNA疫苗中的应用，牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；牛病毒性腹泻病毒截短E2蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID NO.10所示。
[0010]本专利技术提供一种含有编码上述的mRNA疫苗的DNA分子的重组质粒或重组微生物细胞在制备预防或治疗牛呼吸道疾病综合征的mRNA疫苗中的应用。
[0011]本专利技术提供一种含有上述的mRNA疫苗的脂质纳米颗粒在制备预防或治疗牛呼吸道疾病综合征的mRNA疫苗中的应用。
[0012]进一步地限定，引发牛呼吸道疾病综合征的病毒是牛病毒性腹泻病毒。
[0013]本专利技术提供一种上述的mRNA疫苗在制备牛病毒性腹泻病毒的抗体中的应用。
[0014]有益效果：1.疫苗设计上本研究以中国BVDV流行亚型1a基因亚型毒株E2蛋白基因序列为基础，通过密码子优化以提高翻译效率。在编码E2蛋白的RNA序列前加上信号肽以提高蛋白分泌量，并且在信号肽序列前端添加T7启动子、5
’
UTR、“cap 1”结构，在编码E2蛋白的RNA序列后端增加3
’
UTR和多聚腺苷酸尾（poly A）等元件以提高mRNA疫苗翻译效率和稳定性，构建表达E2靶抗原候选mRNA疫苗。并且通过表达截短后的E2蛋白构建高分泌水平的候选mRNA疫苗。
[0015]通过体外细胞转染实验与Western Blot实验验证了构建的候选mRNA疫苗在HEK
‑
293T细胞内的表达以及胞外分泌表达，并验证了E2蛋白的二聚体形式， 表达截短E2蛋白的BVDV tE2候选mRNA疫苗表达更多的分泌E2单体蛋白与E2二聚体蛋白。
[0016]2.免疫效果将验证表达的质粒通过体外转录制备mRNA。通过脂质纳米颗粒包装、电镜检测等质量分析，制备成BVDV E2 mRNA疫苗。将构建好的候选mRNA免疫小鼠和犊牛，均可诱导产生针对BVDV的高水平IgG抗体和中和抗体，并且其对于BVDV
‑
1多种不同基因亚型毒株具有交叉保护性。安全性实验表明制备的mRNA候选疫苗具备安全性。牛的攻毒实验表明，BVDV E2 mRNA疫苗对国内流行基因亚型BVDV
‑
1b JL毒株具有良好的保护作用，表明了该mRNA疫苗对异源现地流行毒株具有交叉保护作用。
附图说明
图1抗原表达载体质粒图谱；图2是抗原表达载体质粒表达验证实验中的Western Blot检测结果；图3是体外转录 mRNA蛋白表达验证实验中的Western Blot检测结果；图4是体外转录mRNA琼脂糖凝胶电泳结果图；图5是LNP
‑
mRNA包装后的电镜分析结果图；图5（A）是牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白的LNP
‑
mRNA包装后，图5（B）是牛病毒性腹泻病毒截短E2蛋白的LNP
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mRNA包装后；图6是BVDV mRNA疫苗与灭活疫苗免疫小鼠的E2特异性IgG抗体
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时间曲线图；图7是BVDV mRNA疫苗与灭活疫苗免疫小鼠的NADL特异性中和抗体抗体
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时间曲线图；图8是BVDV mRNA疫苗与灭活疫苗免疫小鼠2免后两周的E2特异性IgG抗体、NADL特异性中和抗体结果；图9是BVDV mRNA疫苗免疫鼠血清的交叉中和实验结果；图10是 BVDV mRNA疫苗免疫牛的NADL特异性中和抗体结果；
图11是BVDV mRNA疫苗与BVDV灭活疫苗免疫牛的NADL特异性中和抗体结果。
具体实施方式
[0017]实施例1.
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牛病毒性腹泻病毒mRNA疫苗的抗原表达载体的构建一、抗原表达载体质粒的构建方法如下：（1）交由金斯瑞生物公司合成以下基因序列：从5
’
至3
’
端分别为T7启动子（SEQ ID NO .4）、5
’
UTR（SEQ ID NO .4）、kozak序列、tP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea Virus）的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗编码牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白或牛病毒性腹泻病毒截短E2蛋白；牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白的序列如SEQ ID NO.9所示；牛病毒性腹泻病毒截短E2蛋白的序列如SEQ ID NO.10所示。2.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，mRNA疫苗由以下成分组成：5
’
端非翻译区、信号肽序列、牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白的编码RNA基因或牛病毒性腹泻病毒E2截短蛋白的的编码RNA基因、3
’
端非翻译区和多聚腺苷酸。3.根据权利要求2所述的mRNA疫苗，其特征在于，5
’
端非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；3
’
端非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；多聚腺苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白的编码RNA基因序列如SEQ ID NO.15所示；...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹鑫，太万博，姜志刚，黄鹤，常继涛，
申请(专利权)人：北京荷牧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：