一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽及其用药制备预防或治疗非酒精性脂肪性肝病药物的应用。本发明专利技术以羊栖菜为原料，利用超临界CO2萃取脱脂，脉冲超声法破碎细胞，碱性蛋白酶酶解，膜超滤、色谱分离纯化得到降血脂和抗氧化寡肽HGYPEM，分子量为732.8Da。本发明专利技术羊栖菜蛋白HGYPEM能显著减少游离脂肪酸诱导的HepG2细胞内脂质堆积，显著降低细胞模型中总胆固醇、甘油三酯的含量；同时，本发明专利技术HGYPEM能够显著提高细胞模型中抗氧化酶活力，有效清除过量活性氧自由基，降低细胞内的氧化应激水平；而且本发明专利技术HGYPEM对HepG2细胞的活力无显著影响，可用于制备预防或治疗非酒精性脂肪性肝病药物。脂肪性肝病药物。

【技术实现步骤摘要】
一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽及其用于制备预防或治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)药物中的应用。

技术介绍

[0002]非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，NAFLD现已成为慢性肝病的重要病因，患病率10％～30％，其中10％～20％为NASH，后者10年内肝硬化发生率高达25％。
[0003]普通成人NAFLD可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发外，还可影响其他慢性肝病的进展，并参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。代谢综合征相关恶性肿瘤、动脉硬化性心脑血管疾病以及肝硬化为影响NAFLD患者生活质量和预期寿命的重要因素。
[0004]NAFLD是当代医学领域的新挑战，非酒精性脂肪性肝病对人类健康的危害仍将不断增加。“二次打击”学说，即脂质沉积和氧化应激损伤是解释NAFLD发病机制的重要理论。因此，针对NAFLD发生发展的分子机制(脂质沉积、氧化损伤)寻找治疗药物成为研究的焦点。有必要进行更多的研究，以满足临床需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术以羊栖菜为原料，制备羊栖菜蛋白，并利用酶解工艺和色谱纯化技术制备具有降血脂和抗氧化功能的寡肽，该寡肽安全、无毒副作用，可以用于制备预防或治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的药物和相关的功能产品。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽，其氨基酸序列为His
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Gly
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Tyr
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Pro
‑
Glu
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Met(HGYPEM)，分子量为732.8Da。
[0007]另一方面，本专利技术提供了上述羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽的制备方法，其包括以下步骤：
[0008]1)羊栖菜的预处理和蛋白提取：将羊栖菜洗净、除杂、晒干，用粉碎机粉碎，过40目筛，利用超临界CO2脱脂技术处理羊栖菜粉，得到脱脂藻粉，将脱脂藻粉加入到Na2HPO4‑
NaH2PO4缓冲液中，利用脉冲超声法对羊栖菜细胞进行破壁处理60～90min，最后过滤、离心，除去固体杂质，冻干，得羊栖菜蛋白提取物；
[0009]2)羊栖菜蛋白的酶解：取上述羊栖菜蛋白提取物，加入到甘氨酸
‑
NaOH缓冲液，调温至50～60℃，调节pH值至8.6～10.6，加入碱性蛋白酶，水解4～5h；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至室温，离心，收集上清液，即羊栖菜蛋白酶解液；
[0010]3)羊栖菜蛋白降血脂寡肽的制备：将羊栖菜蛋白酶解液经截留分子量为1.0kDa、
3.5kDa和5.0kDa的超滤膜进行分级，收集分级组分(MW<1kDa、1kDa<MW<3.5kDa、3.5kDa<MW<5.0kDa和MW>5.0kDa)，检测各组分降低HepG2细胞模型中脂质和活性氧自由基(ROS)含量的能力，选择降脂和清除ROS效果最佳超滤组分依次经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH
‑
20)柱层析和反相高效液相色谱(RP
‑
HPLC)纯化，得到羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽。
[0011]作为优选，所述步骤1)的超临界CO2脱脂条件为：萃取压力32MPa，萃取温度36～40℃，萃取时间4.5～5.0h，分离压力5.0～5.5Mpa。
[0012]作为优选，所述步骤1)的脉冲超声法对羊栖菜细胞进行破壁处理的工艺参数为：对应一个脉冲的超声发出时间3s和间隙时间2s、超声处理时间60～90min、超声功率600～800W、料液温度20～25℃。
[0013]作为优选，所述步骤1)中Na2HPO4‑
NaH2PO4缓冲液的浓度为0.2mol/L，PH7.0，所述脱脂藻粉与Na2HPO4‑
NaH2PO4缓冲液的料液比1g:25～30mL。
[0014]作为优选，所述步骤2)中甘氨酸
‑
NaOH缓冲液的浓度为0.05mol/L，所述羊栖菜蛋白提取物与甘氨酸
‑
NaOH缓冲液的料液比为1g:10～12mL。
[0015]作为优选，所述步骤2)中的碱性蛋白酶的添加量为羊栖菜蛋白提取物重量2.5～3.5％。
[0016]作为优选，所述步骤3)的羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH
‑
20)柱层析和RP
‑
HPLC纯化的具体过程为：
[0017]凝胶柱层析：将上述降脂效果最佳超滤组分溶于双蒸水配成浓度为70～80mg/mL的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH
‑
20)柱层析(2.6
×
120cm)分离，用双蒸水进行洗脱，流速0.8～1.0mL/min，根据220nm下的凝胶层析色谱图，收集各色谱峰组分，测定个色谱峰组分对HepG2细胞模型中脂质堆积和ROS含量的影响效果，选择降低脂质堆积和清除ROS效果最好的色谱峰组分，冻干，得羊栖菜蛋白降血脂凝胶层析酶解物。
[0018]RP
‑
HPLC纯化：将上述羊栖菜蛋白降血脂凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100μg/mL的溶液，利用RP
‑
HPLC进行纯化，根据制备多肽的降血脂和清除ROS能力得1个高活性寡肽His
‑
Gly
‑
Tyr
‑
Pro
‑
Glu
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Met(HGYPEM)，ESI
‑
MS测定分子量为732.8Da。
[0019]进一步地，所述RP
‑
HPLC条件为：进样量18～20μL；色谱柱Diamonsil C18(250mm
×
4.6mm,5μm)；流动相：乙腈
‑
甲醇
‑
0.1％冰醋酸(25:5:70)为流动相；洗脱速度0.8～1.2mL/min；紫外检测波长220nm。
[0020]再一方面，本专利技术提供了一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽在制备治疗或预防非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。
[0021]本专利技术羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽HGYPEM可显著降低HepG2细胞脂质堆积模型中甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量，显示良好的降脂活性；同时，能够显著提高细胞模型中抗氧化酶水平，有效清除过量活性氧自由基，降低氧化应激损伤，可以用于制备治疗或预本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽，其特征在于，所述寡肽的氨基酸序列为His
‑
Gly
‑
Tyr
‑
Pro
‑
Glu
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Met(HGYPEM)，其分子量为732.8Da。2.一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)羊栖菜的预处理和蛋白提取：将羊栖菜洗净、除杂、晒干，用粉碎机粉碎，过40目筛，利用超临界CO2脱脂技术处理羊栖菜粉，得到脱脂藻粉，将脱脂藻粉加入到Na2HPO4‑
NaH2PO4缓冲液中，利用脉冲超声法对羊栖菜细胞进行破壁处理60～90min，最后过滤、离心，除去固体杂质，冻干，得羊栖菜蛋白提取物；2)羊栖菜蛋白的酶解：取上述羊栖菜蛋白提取物，加入到甘氨酸
‑
NaOH缓冲液，调温至50～60℃，调节pH值至8.6～10.6，加入碱性蛋白酶，水解4～5h；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至室温，离心，收集上清液，即羊栖菜蛋白酶解液；3)羊栖菜蛋白降血脂寡肽的制备：将羊栖菜蛋白酶解液经截留分子量为1.0kDa、3.5kDa和5.0kDa的超滤膜进行分级，收集分级组分(MW<1kDa、1kDa<MW<3.5kDa、3.5kDa<MW<5.0kDa和MW>5.0kDa)，检测各组分降低HepG2细胞模型中脂质和活性氧自由基(ROS)含量的能力，选择降脂和清除ROS效果最佳超滤组分依次经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH
‑
20)柱层析和反相高效液相色谱(RP
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HPLC)纯化，得到羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽。3.如权利要求2所述一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的超临界CO2脱脂条件为：萃取压力32MPa，萃取温度36～40℃，萃取时间4.5～5.0h，分离压力5.0～5.5Mpa。4.如权利要求2所述一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的脉冲超声法对羊栖菜细胞进行破壁处理的工艺参数为：对应一个脉冲的超声发出时间3s和间隙时间2s、超声处理时间60～90min、超声功率600～800W、料液温度20～25℃。5.如权利要求2所述一种羊栖菜蛋白降血脂和抗氧化寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中Na2HPO4‑
NaH2PO4缓冲液的浓度为0.2mol/L，PH7.0，所述脱脂藻粉与Na2HPO4‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：张祯婕，王斌，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：