一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白AI的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白AI的纯化方法，纳米抗亲和介质的制备方法包括如下步骤：构建纳米抗工程菌并对菌种进行诱导表达，得重组蛋白包涵体；将包涵体复性、纯化，得复性后的纳米抗蛋白溶液；纳米抗亲和介质偶联，得纳米抗亲和介质偶联物。载脂蛋白AI的纯化方法包括如下步骤：将纳米抗亲和介质偶联物装入层析柱，用缓冲液过柱平衡；调节载脂蛋白AI溶液pH至7

【技术实现步骤摘要】
一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白AI的纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体而言，涉及一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白AI的纯化方法。

技术介绍

[0002]脂蛋白颗粒的蛋白质成分称为载脂蛋白(Apo)，包括载脂蛋白AI(ApoA
‑
I)；载脂蛋白AI是HDL主要成分蛋白及功能执行者，是HDL参与RCT途径的关键因子，且还参与先天体液免疫，具有抗炎症潜能及抗氧化能力；此外，载脂蛋白AI与HDL含量为动脉粥样硬化及心血管疾病的判定及预测提供了有价值的指标，具有重要的诊断和预防意义。
[0003]目前，虽然载脂蛋白AI的纯化方法已有报道，但这些方法均有不尽人意之处，主要表现在生产周期较长、产生过量的再生废液、有机溶剂安全性差且易造成仪器设备及环境的污染；操作成本高、得率较低、纯化步骤繁琐，不适合大规模地、高效地纯化载脂蛋白AI；样品要求高、分辨率不高等因素，导致纯化的载脂蛋白AI活性差、回收率低，效果不理想的方面。
[0004]因此，亟需一种操作简便、纯化率高、成本低、耗时短，可应用于工业化大规模生产的载脂蛋白AI的分离纯化方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白AI的纯化方法，通过在亲和层析系统基础上开发了一种纳米抗亲和介质，以此为配基固定到基质分离纯化载脂蛋白AI，该介质吸附容量稳定，相较于其他亲和介质更易洗脱，有效克服了当前载脂蛋白AI在纯化过程中存在的多个技术难题。同时，利用本专利技术分离纯化载脂蛋白AI，整个过程操作简便、纯化率高、成本低、耗时短，可应用于工业化大规模生产。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：
[0007]一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质的制备方法，包括如下步骤：
[0008]S1：构建纳米抗工程菌并对菌种进行诱导表达，得重组蛋白包涵体；
[0009]S2：将包涵体复性、纯化，得复性后的纳米抗蛋白溶液；
[0010]S3：纳米抗与层析介质偶联，具体包括如下步骤：
[0011]S31：取环氧活化的介质微球，用纯化水多次重悬抽干后，再用缓冲液多次重悬抽干，最后将介质置换到缓冲液中；
[0012]S32：将S2中所得纳米抗蛋白溶液浓缩至1
‑
5mg/mL；
[0013]S33：将步骤S31和步骤S32中样品按照1：(0.8
‑
1.5)体积比、20
‑
40℃下温和混匀14
‑
20h后，抽干溶液后纯水清洗，然后加入乙醇胺，室温震荡，再抽干溶液；
[0014]S34：加入Tris
‑
HCl清洗后抽干溶液；加入乙酸钠，混匀后抽干溶液；
[0015]S35：加入乙醇并于0
‑
10℃下保存，得纳米抗亲和介质偶联物。
[0016]优选地，步骤S1中，所述纳米抗工程菌的构建方法，步骤如下：
[0017]根据纳米抗蛋白氨基酸序列进行PCR反应，依据反应结束得到的cDNA为模板扩增纳米抗工程菌目的基因；其中，纳米抗蛋白氨基酸序列如SEQNO.1所示；纳米抗工程菌目的基因如SEQNO.2所示；
[0018]采用XhoI和HindIII酶切所述扩增片段与载体质粒Pet
‑
21a，T4连接酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接，构建重组表达载体；
[0019]将所述重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE)感受态细胞中，转染成功后测序分析验证阳性克隆，得到纳米抗工程菌。
[0020]优选地，步骤S1中，纳米抗工程菌的诱导表达步骤如下：
[0021]将所述纳米抗工程菌接种于LB
‑
Amp固体培养基培养12
‑
16h，挑取单菌落接种于LB
‑
Amp培养基，获得活化种子培养基；
[0022]将所述活化种子培养基按照3％(V/V)比例接种于LB
‑
Amp培养基，35
‑
40℃培养至OD
600
达到0.6
‑
0.8，采用终浓度0.1mM的异丙基硫代半乳糖昔IPTG诱导培养液，30℃诱导8
‑
12h；
[0023]将上述培养液加入上样缓冲液悬浮沉淀，超声破碎菌体，超声破碎菌体条件为：功率300W，超声5s间隔5s，重复200次；
[0024]诱导全菌液、超声破菌上清液与超声破菌沉淀分别加入4
×
上样缓冲液，电泳处理进行蛋白表达分析，得到包涵体。
[0025]优选地，所述上样缓冲液中含有35
‑
65mMNaH2PO4、250
‑
360mM NaCl；且100mL菌液与20
‑
35mL上样缓冲液相结合。
[0026]优选地，所述待测样品与4
×
上样缓冲液的体积比为(2
‑
5):1，煮沸8
‑
20min；采用SDS
‑
PAGE电泳进行蛋白表达分析。
[0027]优选地，步骤S2中，包涵体复性、纯化的具体步骤为：
[0028]用洗涤缓冲液洗涤包涵体后离心去除上清，然后溶解于变性缓冲液，包涵体与变性缓冲液添加量比例为1:8
‑
12；再搅拌离心，得变性后的包涵体；
[0029]采用稀释法对变性溶解后的包涵体进行复性；并在变性条件下对包涵体进行分离纯化，收集洗脱峰后过柱，得到复性的纳米抗蛋白溶液。
[0030]优选地，所述的洗涤缓冲液是pH7.0
‑
8.5、含有50mM Tris、1
‑
3mM EDTA的1
‑
3M尿素；
[0031]所述的变性缓冲液是pH8
‑
9、含有20mM Tris的7
‑
10M脲。
[0032]优选地，步骤S3中，所述的缓冲液中含有0.1
‑
0.5M NaHCO3与0.2
‑
0.7M NaCl，置换液pH为8
‑
9。
[0033]一种载脂蛋白AI的纯化方法，采用任一上述的方法制备得到的纳米抗亲和介质作为层析介质。
[0034]优选地，所述载脂蛋白AI的纯化方法，包括如下步骤：
[0035]S51：将纳米抗亲和介质偶联物装入层析柱，用缓冲液过柱平衡；
[0036]S52：调节载脂蛋白AI溶液pH至7
‑
8，上样后用缓冲液淋洗至基线；
[0037]S53：采用pH为1
‑
3的柠檬酸洗脱，收集洗脱峰。
[0038]本专利技术以纳米抗工程菌作为偶联填料与亲和层析介质偶联，纯化后载脂蛋白AI与
烘烤处理纯化后载脂蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于载脂蛋白AI的纳米抗亲和介质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：构建纳米抗工程菌并对菌种进行诱导表达，得重组蛋白包涵体；S2：将包涵体复性、纯化，得复性后的纳米抗蛋白溶液；S3：纳米抗与层析介质偶联，具体包括如下步骤：S31：取环氧活化的介质微球，用纯化水多次重悬抽干后，再用缓冲液多次重悬抽干，最后将介质置换到缓冲液中；S32：将S2中所得纳米抗蛋白溶液浓缩至1
‑
5mg/mL；S33：将步骤S31和步骤S32中样品按照1：(0.8
‑
1.5)体积比、20
‑
40℃下温和混匀14
‑
20h后，抽干溶液后纯水清洗，然后加入乙醇胺，室温震荡，再抽干溶液；S34：加入Tris
‑
HCl清洗后抽干溶液；加入乙酸钠，混匀后抽干溶液；S35：加入乙醇并于0
‑
10℃下保存，得纳米抗亲和介质偶联物。2.根据权利要求1所述的纳米抗亲和介质制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述纳米抗工程菌的构建方法，步骤如下：根据纳米抗蛋白氨基酸序列进行PCR反应，依据反应结束得到的cDNA为模板扩增纳米抗工程菌目的基因；其中，纳米抗蛋白氨基酸序列如SEQNO.1所示；纳米抗工程菌目的基因如SEQNO.2所示；采用XhoI和HindIII酶切所述扩增片段与载体质粒Pet
‑
21a，T4连接酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接，构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE)感受态细胞中，转染成功后测序分析验证阳性克隆，得到纳米抗工程菌。3.根据权利要求1所述的纳米抗亲和介质制备方法，其特征在于，步骤S1中，纳米抗工程菌的诱导表达步骤如下：将所述纳米抗工程菌接种于LB
‑
Amp固体培养基培养12
‑
16h，挑取单菌落接种于LB
‑
Amp培养基，获得活化种子培养基；将所述活化种子培养基按照3％(V/V)比例接种于LB
‑
Amp培养基，35
‑
40℃培养至OD
600
达到0.6
‑
0.8，采用终浓度0.1mM的异丙基硫代半乳糖昔IPTG诱导培养液，30℃诱导8
‑
12h；将上述培养液加入上样缓冲液悬浮沉淀，超声破碎菌体，超声破碎菌体条件为：功率300W，超声5s间隔5s，重...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永刚，刘永东，
申请(专利权)人：江苏帆博生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：