一种高效低成本外源表达透明质酸工程菌的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种高效低成本外源表达透明质酸工程菌的构建方法及应用，属于工程微生物技术领域。本发明专利技术以黄原胶合成菌株野油菜黄单胞菌NRRL B

【技术实现步骤摘要】
一种高效低成本外源表达透明质酸工程菌的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于工程微生物
，具体涉及一种外源表达透明质酸工程菌的构建方法以及基于该菌株的透明质酸生物合成方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]微生物多糖因具有独特的物理化学性质、生物活性及安全稳定性，作为乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、保湿剂、成膜剂、润滑剂及保鲜剂等广泛应用于食品、制药、石油、日化、农业等领域，微生物多糖无毒安全、具有生产周期短、易于分离纯化等特点，可以通过生物技术途径从廉价的可再生原料中制备，受到了产业界与学术界的密切关注，已逐渐成为动物和植物来源多糖产品的有效替代品。然而，目前工业生产的微生物多糖仍然局限于少量几种从自然界选育的微生物如透明质酸(Hyaluronic acid，HA)、黄原胶(Xanthan Gum)、结冷胶(Gellan Gum)等，其产量和功能还受到许多限制。特别是透明质酸由于其合成菌种的代谢对培养基营养要求高但产率低导致生产成本居高不下，已成为其应用拓展的严重制约。
[0004]野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)可利用淀粉为原料发酵合成微生物多糖黄原胶(Xanthan gum)，产率可达到45g/L以上，糖转化率可达到80％，在高粘度多糖合成效率、廉价底物适应性、生物安全等方面均具有突出优势，是理想的构建微生物多糖通用底盘细胞平台的基础菌株。野油菜黄单胞菌可在高粘度、低氧条件下高效利用淀粉大量合成多糖分子且糖代谢途径中可大量合成如UDP
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Glc、UDP
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GlcUA、UDP
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GlcNAc等多糖合成的前体物质，适合高效表达多种高粘度微生物多糖如透明质酸、结冷胶、韦兰胶等。此外也有报道利用芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母菌等通过外源表达获得透明质酸，由于技术限制均未能实现工业化生产，但通过外源表达高效合成透明质酸为从根本上解决透明质酸生产的瓶颈问题提供了方法借鉴。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是高粘度微生物多糖发酵产率低、生产成本居高不下等一系列技术问题。为了解决上述技术问题，本专利技术基于现有微生物多糖黄原胶合成菌株进行代谢流的改造，获得一种能够低成本外源表达透明质酸的底盘菌，应用于透明质酸合成领域具有良好的应用前景。具体的，上述方案通过以下技术方案实现：
[0006]第一方面，提供一种外源表达透明质酸的工程菌，其出发菌株为外源表达黄原胶的野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)；相比该出发菌株，所述工程菌被修饰为具有增加的透明质酸合成酶表达，同时抑制黄原胶代谢合成活性。
[0007]上述方案中，所述“被修饰为具有增加的透明质酸合成酶表达，同时抑制黄原胶代
谢合成活性”，其含义在于，工程菌株相比出发菌株进行了基因修饰，改造后透明质合成酶的活性增加，而黄原胶代谢合成活性被抑制；其中，活性增加可行的改造方式如引入外源活性基因，而活性抑制可行的改造方式如抑制相关基因的表达或修饰表达调控序列。
[0008]本专利技术验证的一种实施方式中，所述工程菌株的出发菌株为黄原胶合成菌株野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)NRRL B
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1459，本专利技术以上述菌株作为出发菌株进行透明质酸合成代谢途径的改造，有助于获得一种对底物及发酵条件要求更低的工程菌株，有利于提高透明质酸生物合成技术的经济收益。
[0009]优选的，所述黄原胶代谢合成活性的抑制是通过抑制gumD表达实现，所述基因表达抑制可通过同源重组进行基因敲除方式实现。应当说明的是，根据出发菌株的差异，其中显示黄原胶代谢合成活性相关的蛋白或基因序列可能存在不同，然而，根据活性显示确认相应的基因甚至基因突变体对本领域技术人员来说不具有难度，仍囊括在本专利技术的技术思路之内。
[0010]优选的，所述透明质酸合成酶为spHasA，一种具体实施方式中，所述spHasA来源于化脓链球菌。
[0011]一种具体的实施方式中，所述工程菌的出发菌株为野油菜黄单胞菌NRRL B
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1459，扩增该菌株中gumD的上下游同源臂基因；并构建相应的敲除质粒转化大肠杆菌，得到重组菌株DH
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5α/pK18mobSacB
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ΔgumD；从重组菌株DH
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5α/pK18mobSacB
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ΔgumD中提取质粒通过电击转化转移至出发菌株中，通过蔗糖致死平板筛选不合成黄原胶的野油菜黄单胞菌多糖合成底盘细胞Xanthomonas campestrisΔgumD；修饰后的Xanthomonas campestrisΔgumD中gumD序列进行了部分敲除，野生型gumD的序列如SEQ ID NO.1所示，敲除后Xanthomonas campestrisΔgumD株当中gumD的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]合成透明质酸合酶基因spHasA，序列如SEQ ID NO.3所示；构建透明质酸合成酶外源表达质粒转化大肠杆菌得到重组菌株DH
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5α/PBBR1
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kan
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Ptac
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spHasA，从重组菌株DH
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5α/PBBR1
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kan
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Ptac
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spHasA中筛选提取质粒电击转化至底盘细胞Xanthomonas campestrisΔgumD中，得到外源表达透明质酸的工程菌，命名为所述工程菌株命名为野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)HA。
[0013]第二方面，提供一种基于上述工程菌株的透明质酸生物合成方法，所述合成方法包括将上述工程菌株的种子液接种至发酵培养基中进行摇瓶发酵；
[0014]所述发酵培养基包括如下比例的各组分：玉米淀粉3.0～5.0g/100mL；大豆粉0.3～0.5g/100mL；碳酸钙0.1～0.3g/100mL；卡那霉素100ng/mL；其他为软化水；pH 7.0～7.2。
[0015]优选的，所述发酵条件为：28～32℃；280～320r/min；接种量为9～11％(v/v)；摇瓶装液量为80mL/500mL，摇瓶发酵时间为70～75h。
[0016]另外，本专利技术还提供上述菌株活化及种子液的制备方法：
[0017]所述菌株活化方法如下：
[0018]将冷藏保存的菌株无菌接种于斜面培养基上，28～32℃静置培养1～2天，获得活化菌种，所述斜面固体培养基为LB培养基，含100ng/mL卡那霉素。
[0019]所述菌株种子液制备方法如下：
[0020]挑取经斜面活化培养的生产菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外源表达透明质酸的工程菌，其特征在于，其出发菌株为黄原胶合成菌株野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestris)NRRL B
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1459；相比该出发菌株，所述工程菌被修饰为具有透明质酸合成酶spHasA表达，同时抑制gumD表达。2.如权利要求1所述外源表达透明质酸的工程菌，其特征在于，所述gumD表达抑制是通过同源重组方式实现。3.如权利要求1所述外源表达透明质酸的工程菌，其特征在于，所述透明质酸合成酶spHasA来源于化脓链球菌。4.如权利要求2或3所述外源表达透明质酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌的构建方式如下：所述工程菌的出发菌株为野油菜黄单孢菌NRRL B
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1459，扩增该菌株中gumD的上下游同源臂基因；并构建相应的敲除质粒转化大肠杆菌，得到重组菌株DH
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5α/pK18mobSacB
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ΔgumD；从重组菌株DH
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5α/pK18mobSacB
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ΔgumD中提取质粒通过电击转化转移至出发菌株中，通过蔗糖致死平板筛选不合成黄原胶的野油菜黄单胞菌多糖合成底盘细胞Xanthomonas campestrisΔgumD；合成透明质酸合酶基因spHasA，序列如SEQ ID NO.3所示；构建透明质酸合成酶外源表达质粒转化大肠杆菌得到重组菌株DH
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5α/PBBR1
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kan
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Ptac
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spHasA，从重组菌株DH
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5α/PBBR1
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kan
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Ptac
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spHasA中筛选提取质...

【专利技术属性】
技术研发人员：董学前，张永刚，王伟，张艳敏，韩鸿宇，刘洋，周思多，刘建军，
申请(专利权)人：山东省食品发酵工业研究设计院，
类型：发明
国别省市：