一种P450酶突变体、编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种P450酶突变体、编码基因及其在制备皮质醇中的应用，属于生物工程技术领域。所述P450酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的智人来源CYP11B1通过氨基酸突变所得，氨基酸突变的位点为S146V、H331D、L440F中的至少一个。本发明专利技术提供的P450酶突变体相对野生型CYP11B1在大肠杆菌中具有更高的可溶性表达水平，构建的重组表达菌株的催化水平更高，可以以11

【技术实现步骤摘要】
一种P450酶突变体、编码基因及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种针对智人来源CYP11B1改造的P450酶突变体、编码基因及其在制备皮质醇中的应用。

技术介绍

[0002]皮质醇(Cortisol)是从肾上腺皮质中提取出的对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素，属于糖皮质激素的一种，在应激生理适应、能量动员和免疫反应的调节中起着至关重要的作用。除用作抗炎药物和免疫抑制剂，皮质醇也被用作合成其他糖皮质激素的中间体，如泼尼松、泼尼松龙等。
[0003]皮质醇是通过肾上腺皮质线粒体中的11β
‑
羟化酶的作用，由11
‑
脱氧皮质醇生成。皮质醇的全化学合成涉及约40个步骤且收率低(Woodward R,Sondheimer F,Taub D,et al.The total synthesis of steroids[J].Journal of the American Chemical Society,1952,74(17):4223
‑
4251.)。在目前的工业生产中主要采用从天然存在的甾醇开始的半合成方法，包括前期多步骤化学过程和最后一步利用弯孢属(Curvularia)或犁头霉属(Absidia)真菌培养物进行微生物转化11
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脱氧皮质醇或其21
‑
醋酸酯生产皮质醇(杨顺楷.甾体微生物转化：糖皮质激素氢化可的松生物转化的鲁棒性及其研究应用[J].应用与环境生物学报,2022,28(01):230
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238.)。但真菌催化过程的选择性较差，常伴随着11α
‑
OH或14α
‑
OH副产物的产生，这需要在下游分离步骤中耗费更多的成本，且真菌的培养和转化时间均较长。
[0004]哺乳动物中皮质醇主要在肾上腺中合成，最后一步11β
‑
羟基化由线粒体P450酶CYP11B1执行。基于CYP11B1专一的羟化功能，已利用人CYP11B1构建重组酿酒酵母菌株从头合成皮质醇，但是实现的生产率和效价较低(分别为1.64mg
·
L
‑1·
d
‑1和11.5mg
·
L
‑1)(Szczebara F M,Chandelier C,Villeret C,et al.Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast[J].Nature Biotechnology,2003,21(2):143
‑
149.)。人CYP11B1与完整电子转移链人皮质铁氧还蛋白(adrenodoxin,Adx)和人皮质铁氧还蛋白还原酶(adrenodoxin reductase,AdR)在粟酒裂殖酵母中共表达后可在72小时内生产1mM的皮质醇(约120.8mg
·
L
‑1·
d
‑1)(Hakki T,Zearo S,C
‑
A,et al.Coexpression of redox partners increases the hydrocortisone(cortisol)production efficiency in CYP11B1 expressing fission yeast Schizosaccharomyces pombe[J].Journal of Biotechnology,2008,133(3):351
‑
359.)。这些皮质醇产率离工业化要求仍有较大的距离，因此，开发基于CYP11B1的高催化活力生物催化剂用于皮质醇的合成是本领域技术人员需要解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种催化活力高、立体选择性专一的细胞色素P450酶用于制备皮质醇，满足工业化生产的要求。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术通过对智人来源的细胞色素P450酶CYP11B1进行酶分子工程改造，获得了催化活力显著提升的P450酶突变体，具体的，所述P450酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的智人来源CYP11B1通过氨基酸突变所得的突变体，其中，所述氨基酸突变的位点为第146位、第331位、第440位中的至少一个，且第146位的丝氨酸突变为缬氨酸，第331位的组氨酸突变为天冬氨酸，第440的亮氨酸突变为苯丙氨酸。
[0008]具体的，第146位的丝氨酸突变为缬氨酸的突变体CYP11B1
‑
S146V，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0009]第331位的组氨酸突变为天冬氨酸的突变体CYP11B1
‑
H331D，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0010]第440位的亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体CYP11B1
‑
L440F，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0011]第146位的丝氨酸突变为缬氨酸且第331位的组氨酸突变为天冬氨酸的突变体CYP11B1
‑
S146V/H331D，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
[0012]第146位的丝氨酸突变为缬氨酸且第440位的亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体CYP11B1
‑
S146V/L440F，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0013]第331位的组氨酸突变为天冬氨酸且第440位的亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体CYP11B1
‑
H331D/L440F，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
[0014]第146位的丝氨酸突变为缬氨酸且第331位的组氨酸突变为天冬氨酸且第440位的亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体CYP11B1
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S146V/H331D/L440F，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0015]研究表明，相较于野生型CYP11B1，上述P450酶突变体在大肠杆菌中的可溶性表达水平显著提升，基因工程菌的全细胞催化活力显著提升。
[0016]对所述P450酶突变体的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本专利技术的范围内。
[0017]针对本专利技术P450酶突变体的获得，可以通过对智人来源CYP11B1的编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)进行定点突变，基因表达后得到所述P450酶突变体。
[0018]本专利技术还提供了用于编码所述P450酶突变体的编码基因，所述编码基因是在SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的基础上对编码相应氨基酸的密码子进行突变获得。具体的，S146V为编码第146位丝氨酸的密码子TCT突变为编码缬氨酸的密码子GTG，H331D为编码第33本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种P450酶突变体，其特征在于，所述P450酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的智人来源CYP11B1通过氨基酸突变所得的突变体，其中，所述氨基酸突变的位点为第146位、第331位、第440位中的至少一个，且第146位的丝氨酸突变为缬氨酸，第331位的组氨酸突变为天冬氨酸，第440的亮氨酸突变为苯丙氨酸。2.如权利要求1所述的P450酶突变体，其特征在于，所述P450酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.8中任一所示。3.一种用于编码如权利要求1或2所述的P450酶突变体的编码基因。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求3所述的编码基因。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包括皮质铁氧还蛋白还原酶编码基因与皮质铁氧还蛋白编码基因，所述皮质铁氧还蛋白还原酶编码基因的上游插入有核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的RBS序列，所述皮质铁氧还蛋白编码基因的上游插入有核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的RBS序列。6.一种用于生产如权利要求1或2所述的P450酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求4或5所述的重组表达载体。7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还包含表达分子伴侣GroEL/ES的pGro7质粒。8.如权利要求1或...

【专利技术属性】
技术研发人员：于洪巍，叶丽丹，张岩峰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：