一种神经营养性角膜炎动物模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种神经营养性角膜炎动物模型的构建方法及其应用，涉及动物模型的技术领域。本发明专利技术将TRPV1

【技术实现步骤摘要】
一种神经营养性角膜炎动物模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于动物模型的
，具体涉及一种神经营养性角膜炎动物模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]神经营养性角膜炎(neurotrophic keratitis，NK)是由于三叉神经支配的角膜神经功能受损而引起的一种退行性角膜疾病，该病发病率小于1.6/10000，较为罕见，常被漏诊误诊。角膜神经损伤导致角膜上皮和基质细胞受损，从而影响这些靶细胞分泌神经营养因子(如神经生长因子NGF等)，进一步加剧角膜神经的病变；同时，角膜神经损伤、NGF降低还可引起泪液分泌减少从而进一步加重角膜病变，导致恶性循环，最终进展为神经营养性角膜炎。该疾病最关键的临床特征是眼表知觉减退或缺失，因此造成临床的漏诊和误诊。
[0003]NK的基础研究与药物治疗亟需合适的动物模型，目前缺乏稳定高效的NK动物模型。目前对于NK的研究最常用的动物模型是立体定位电灼损伤三叉神经的眼支，多用大鼠进行建模，成模率约60％，术后仅能存活3
‑
6天。因小鼠体型小，手术操作难度大，模型没有广泛应用。其次是新生小鼠皮下注射辣椒素，在3周时开始出现表型，建模周期长且个体差异大，病情的严重程度在一定程度上取决于辣椒素的使用剂量。为此，亟需一种构建周期短、简单稳定的NK动物模型，能贴合临床进行分期并且符合临床疾病进展的标准。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种神经营养性角膜炎动物模型的构建方法，本专利技术利用实验广泛应用的小鼠进行建立，模型简单稳定、周期短，能贴合临床进行分期并且符合临床疾病进展的标准。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种神经营养性角膜炎动物模型的构建方法，包括如下步骤：将TRPV1
Cre
小鼠与ROSA26i
‑
DTR小鼠合笼，筛选出TRPV1
‑
DTR双杂合小鼠后，对所述TRPV1
‑
DTR双杂合小鼠进行白喉毒素注射，注射处理21天即得神经营养性角膜炎小鼠模型。
[0007]优选地，所述白喉毒素的注射频次为每天注射1次，连续注射5天然后停2天。
[0008]更优选地，所述白喉毒素的注射剂量为每只小鼠每次注射200ng。
[0009]优选地，待TRPV1
‑
DTR双杂合小鼠体重至20g以上后进行白喉毒素注射。
[0010]更优选地，所述白喉毒素注射方式为腹腔注射。
[0011]优选地，所述筛选TRPV1
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DTR双杂合小鼠的方式为对小鼠进行基因型鉴定。
[0012]更优选地，所述基因型鉴定方法包括如下步骤：将出生4周后的子代小鼠与父母本分离，并进行标记；获得子代小鼠基因组DNA；然后进行PCR扩增反应，使用2％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。
[0013]本专利技术还提供了上述构建方法获得的神经营养性角膜炎动物模型。
[0014]本专利技术还提供了上述的神经营养性角膜炎动物模型在制备治疗神经营养性角膜
炎药物中的应用。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果：
[0016]本专利技术构建的动物模型与对照组相比，TRPV1感觉神经消融的小鼠角膜敏感度、泪液分泌量显著降低，裂隙灯成像显示角膜上皮有缺损；TRPV1感觉神经消融小鼠角膜神经密度显著降低，新生血管明显增多；OCT成像与HE切片染色显示TRPV1感觉神经消融小鼠角膜明显水肿，角膜铺片染色也表明其炎症细胞大量浸润。TRPV1感觉神经消融小鼠眼部表型能模拟临床患者神经营养性角膜炎分型，为研究神经营养性角膜炎的发病机制和治疗提供了高效稳定的动物模型。
[0017]临床NK分为三期，一期：泪液分泌减少，角膜上皮点状缺损；二期：角膜上皮脱落、基质水肿；三期：角膜溃疡，基质溶解甚至穿孔。本专利技术的建模周期为21天，21天几乎全部TRPV1感觉神经消融小鼠都成模。本专利技术构建的动物模型利用实验广泛应用的小鼠进行建立，是第一个NK遗传模型，模型简单稳定、周期短，能贴合临床进行分期并且符合临床疾病进展的标准。
附图说明
[0018]图1为TRPV1
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DTR小鼠鉴定，其中图1A为TRPV1
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DTR小鼠基因型鉴定结果，图1B为TRPV1
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DTR小鼠冰冻切片免疫荧光染色结果；
[0019]图2为TRPV1感觉神经消融小鼠角膜表型，其中图2A为TRPV1
‑
DTR小鼠在注射DT过程中不同时间点的泪液分泌量变化，图2B为TRPV1
‑
DTR小鼠在注射DT过程中不同时间点的角膜敏感度变化，图2C为TRPV1
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DTR小鼠在注射DT过程中不同时间点的角膜大体照；d,day；ns，not significant；***P＜0.001；
[0020]图3为TRPV1感觉神经消融小鼠神经退行、血管长入结果，其中图3A为TRPV1感觉神经消融小鼠及其对照小鼠角膜大体照(左列)及角膜铺片免疫荧光染色(右列，β3
‑
tubulin，绿色，指示角膜神经)；图3B为TRPV1感觉神经消融小鼠及其对照小鼠角膜大体照(左列)及角膜铺片免疫荧光染色(右列，CD31，红色，指示角膜血管)；图3C为TRPV1感觉神经消融小鼠及其对照小鼠角膜qPCR检测血管生长因子Vegfa的表达；****P＜0.0001；
[0021]图4为TRPV1神经消融小鼠角膜炎症增强反应结果，其中TRPV1感觉神经消融小鼠及其对照小鼠角膜OCT成像(左列)、切片HE染色(中间列)、角膜铺片免疫荧光染色(右列，CD45，绿色，指示角膜免疫细胞)；图4B为TRPV1感觉神经消融小鼠及其对照小鼠角膜qPCR检测炎症因子Tnf
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α、Il
‑
6、Il
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1β的表达；****P＜0.0001。
具体实施方式
[0022]本专利技术提供了一种神经营养性角膜炎动物模型的构建方法，包括如下步骤：将TRPV1
Cre
小鼠与ROSA26i
‑
DTR小鼠合笼，筛选出TRPV1
‑
DTR双杂合小鼠后，对所述TRPV1
‑
DTR双杂合小鼠进行白喉毒素注射，注射处理21天即得神经营养性角膜炎小鼠模型。在本专利技术中，所述TRPV1
Cre
小鼠与ROSA26i
‑
DTR小鼠均购自The Jackson Laboratory，其中TRPV1
Cre
小鼠货号为Jax：017769；ROSA26i
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DTR小鼠货号为Jax：007900。
[0023]在本专利技术中，所述白喉毒素的注射频次为每天注射1次，连续注射5天然后停2天。
[0024]在本专利技术中，所述白喉毒素的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种神经营养性角膜炎动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将TRPV1
Cre
小鼠与ROSA26i
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DTR小鼠合笼，筛选出TRPV1
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DTR双杂合小鼠后，对所述TRPV1
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DTR双杂合小鼠进行白喉毒素注射，注射处理21天即得神经营养性角膜炎小鼠模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述白喉毒素的注射频次为每天注射1次，连续注射5天然后停2天。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述白喉毒素的注射剂量为每只小鼠每次注射200ng。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，待TRPV1
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：周庆军，王晓磊，赵磊磊，杨玲玲，李雅，
申请(专利权)人：山东第一医科大学附属眼科研究所山东省眼科研究所，山东第一医科大学附属青岛眼科医院，
类型：发明
国别省市：