编码sCOO的序列及应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及编码sCOO的序列及应用。本发明专利技术利用人工合成的序列，创造性的选择假单胞菌作为宿主菌，将假单胞菌密码子的优化序列建到表达载体中，实现了在假单胞菌中的高效表达（33KU/L)，表达产物纯化后可用于胆固醇含量检测相关试剂盒的开发。化后可用于胆固醇含量检测相关试剂盒的开发。化后可用于胆固醇含量检测相关试剂盒的开发。

【技术实现步骤摘要】
编码sCOO的序列及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及编码sCOO的序列及应用。

技术介绍

[0002]胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COO)是一种FAD依赖的黄素酶，根据与FAD的不同结合方式可分为I型(非共价结合)与Ⅱ型(共价结合)。COO属于氧化还原酶家族，主要微生物来源有链霉菌属(Strptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、芽孢菌属(Bacillus)等；COO能够催化胆固醇生成胆甾4
‑
烯
‑3‑
酮和过氧化氢，因此广泛应用于临床上胆固醇含量的检测。
[0003]目前研究较多且临床应用较多的主要是来源于链霉菌属的Ⅰ型COO，然而由于野生天然链霉菌属产量较低，约为6KU/L,且链霉菌发酵工艺相对复杂，所以难以进行大规模生产。此外，FazaeliA等尝试过在大肠杆菌中进行该酶的重组表达，结果表明可溶性胆固醇氧化酶(sCOO)表达量非常低，约为0.16KU/L。因此如何进行I型COO的异源表达获得可溶性蛋白是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于利用恶臭假单胞菌进行I型COO的可溶性异源表达，构建获得能够稳定表达、产量较高的COO生产菌株，且生产的蛋白能够满足临床试剂需求。
[0005]具体如下：
[0006]编码sCOO的序列，所述序列如SEQ ID No.1所示。/>[0007]本专利技术编码sCOO的序列根据假单胞菌密码子优化，能够有利于利用假单胞菌进行表达。
[0008]另一方面，本专利技术提供一种重组表达质粒，所述重组表达质粒含有所述的编码sCOO的序列。
[0009]进一步地，所述重组表达质粒含有Trc、Trp、Lac或Tac启动子。
[0010]优选的，所述重组表达质粒启动子为Tac启动子。
[0011]进一步地，所述重组表达质粒所需载体选自pBBR122、pBHR1或pBBRMCS2载体。
[0012]优选为，pBBRMCS2载体。
[0013]进一步地，所述重组表达质粒启动子为Tac启动子，所述重组表达质粒所需载体为pBBRMCS2载体。
[0014]本专利技术发现，Tac启动子，是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，用其替换pBBRMCS2载体自身的Lac启动子，表达水平优于载体原来启动子。
[0015]另一方面，本专利技术公开了重组菌，其特征在于，所述重组菌中的菌株为假单胞菌，优选的，所述假单胞菌为恶臭假单胞菌KT2440。
[0016]恶臭假单胞菌(PseudomonasputidaKT2440)是一种非致病性、遗传背景清晰的菌株，非常适合进行外源基因诱导表达。使用其表达胆固醇氧化酶，能够克服在大肠杆菌中可
溶性表达量非常低的问题，且表达量远高于野生天然链霉菌属的产量。
[0017]另一方面，本专利技术提供一种可溶性胆固醇氧化酶的表达方法，包括如下步骤：
[0018](1)人工合成SEQ ID No.1；
[0019](2)将SEQ ID No.1插入载体中，构建重组表达质粒；
[0020](3)将所述重组表达质粒转入菌株，构建重组菌，表达所述可溶性胆固醇氧化酶。
[0021]进一步地，所述菌株选自KT2440。
[0022]进一步地，所述转入的方法为电击。
[0023]进一步地，所述步骤(3)之后还包括(4)重组菌筛选，所述筛选的培养基为含卡那霉素抗性的LB固体培养基。
[0024]另一方面，本专利技术公开了KT2440在表达胆固醇氧化酶中的应用，所述KT2440中含有SEQ ID No.1。
[0025]有益效果：
[0026]本专利技术创造性的选择KT2440作为宿主菌，将假单胞菌密码子的优化序列建到表达载体中，实现了可溶性胆固醇氧化酶在恶臭假单胞菌中的高效表达(33KU/L)，表达产物纯化后可用于胆固醇含量检测相关试剂盒的开发。
附图说明
[0027]图1：sCOO纯化凝胶图。
具体实施方式
[0028]提供下述实施例是为了更好地进一步理解本专利技术，并不局限于所述最佳实施方式，不对本专利技术的内容和保护范围构成限制，任何人在本专利技术的启示下或是将本专利技术与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本专利技术相同或相近似的产品，均落在本专利技术的保护范围之内。
[0029]实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0030]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文所描述的方法和材料，以及类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
[0031]如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”及其变体旨在是开放式的，不排除附加行为或结构的可能性的过渡性短语、术语或词语。
[0032]以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。
[0033]实施例1：sCOO表达载体构建
[0034]根据链霉菌属(streptomycessp.)来源的序列(Genebank登录号：M31939.1)，按照假单胞菌密码子优化原则进行序列设计，优化后的序列如SEQ ID No.1所示，与原始序列一致性约为75％。在SEQ ID No.1的5
’
端添加Tac启动子序列，具体如SEQ ID No.2所示。设计好的序列交由上海捷瑞生物工程公司进行合成。分别设计SEQ ID No.3和SEQ ID No.4两条引物，用合成产物作为模板，扩增出含有Tac启动子和优化后COO目的序列的产物1；分别设
计SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6两条引物，用pBBRMCS2为模板，扩增出产物2；产物1和产物2用无缝克隆试剂盒(汉恒生物技术有限公司)进行克隆,获得表达载体pBBR
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sCOO；
[0035]在一些实施方式中，所述启动子也可以选择Trc、Trp或Lac。
[0036]所述载体还可以选择pBBR122或pBHR1。
[0037]本领域技术人员可以根据引物设计规则，设计合适的引物。
[0038]实施例2：制备恶臭假单胞菌KT2440宿主菌感受态细胞
[0039]于
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80℃冰箱取出KT2440菌株，冰上解冻后于无抗性LB固体培养基上划线，37℃倒置过夜培养，挑单克隆于5mLLB液体培养基中，37℃摇床过夜培养；吸取500μL菌液转接至50mL新鲜LB液体培养基中，37℃摇床培养至OD600＝0.8左右，立即冰浴10mi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.编码sCOO的序列，其特征在于，所述序列如SEQ ID No.1所示。2.一种重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒中含有权利要求1中所述的编码sCOO的序列。3.如权利要求2所述的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒含有Trc、Trp、Lac或Tac启动子。4.如权利要求2或3所述的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒所需载体选自pBBR122 、pBHR1或pBBRMCS2载体。5.重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求1所述的优化序列或权利要求2或3所述的重组表达质粒。6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中的菌株为假单胞菌，优选的，所述假单胞菌为恶臭假单胞菌KT2440。7.一种可溶性...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵伟，王建琴，易维京，
申请(专利权)人：重庆艾生斯生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：