一种坛紫菜分子标记辅助选择育种方法技术

本发明专利技术属于坛紫菜分子育种技术领域，具体提供一种建立坛紫菜分子标记辅助选择的杂交育种体系的方法，该方法能快速有效地选择具有优良性状的品系，缩短育种进程，为紫菜育种的发展提供一种新的育种体系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于坛紫菜分子育种
，只体涉及。
技术介绍
坛紫菜属于红藻门(Rphdophyta)原红藻纲(Protoflorideophyceae)红毛菜目(Bangiales)红毛 菜科(Bangiaceae)紫菜属(/^rp/y/ra),是我国紫菜主要养殖品种之一，主要分布福建、浙江、 广东沿海，具有极高的营养价值和经济价值。目前紫菜育种技术采用的仍然是传统的选择ff 种、诱变育种等方法，使得紫菜养殖品种的遗传基础日益狭隘， 一些重要的栽培性状如产量、 品质、耐高温性、抗病性均不同程度的丢失，从而限制了我国紫菜养殖业的发展。杂交育种 可以使得亲本的优良性状在后代得到积累和遗传，但传统的杂交育种对性状的选择是基于表 型，由于坛紫菜生活史的特殊性，存在着两型生活世代即孢子体世代和配子体世代，这将使 得选择效率大大降低。分子标记辅助选择(molecular maker-assisted selection)是根据目标性状的 分子标记，对育种后代进行选择的一种育种方法。其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或 表现共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘, 获得期望的个体,达到提高育种效率的目的。由于分子标记不受环境条件影响，能够快速有效地 选择出带有目标性状的单株、加速优良基因的聚合和提高作物数量性状的选择，因而这种方 法可以提高育种选择的准确性，缩短育种周期，加快育种进程。 近些年来海水养殖业的迅速发展，分子标记辅助育种技术在海洋经济物种也相继使用， 但在紫菜养殖和育种中却很少应用。因此建立坛紫菜分子标记辅助选择的杂交育种体系对于 改进紫菜育种技术、加快育种进程、选育优良品系、促进紫菜养殖业的发展具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种建立坛紫菜分子标记辅助选择的杂交育种体系的方法，该方法 能快速有效地选择具有优良性状的品系，缩短育种进程，为紫菜育种的发展提供一种新的育 种体系。为了实现上述目的，采用以下技术方案1、将坛紫菜野生资源的贝壳丝状体，置于光照培养箱内进行丝状体光照培养(培养条件为温度20土rC，光照20nmohn—2^，光周期12L:12D)，待藻丝布满整个贝壳时，进行孢子囊枝的诱导(培养条件为温度29土rC，光照lOnmol'm—^-1,光周期10L:14D)。随后壳孢子大 量释放，萌发形成壳孢子苗，改变培养条件(培养条件为温度20土rc，光照4(Vmol.m《s—1， 光周期12L:12D),通气培养30天后，壳孢子苗进一歩发育成叶状体，将具有不同性状表型 的叶状体放置在单独的培养瓶中隔离培养，培养至性成熟。测定各个体的目标性状表型(例如目标性状为生长速率和/或成熟期。生长速率的测定采用在相同培养条件下培养叶状体，每隔 三天测量其生长量，包括叶长和叶宽，计算叶面积。成熟期的测定采用的方法是，壳孢子苗 培养30天后，雄性个体丌始成熟，将此时成熟的雄性个体视为早熟个体，两周后雄性个体大 量成熟，同时雌性个体开始成熟，将此时的雄性个体视为中熟个体，两周后，雌性个体大量 成熟，但仍有少量雄性个体成熟，视为晚熟个体)。对具有目标性状表型的个休分别进行^细胞酶解，即将冲洗干净的叶状体用吸水纸将表 面水分吸干，用刀片将叶状体充分切碎，放入盛有粒崃螺粗酶液(本专利技术所用的粒嵘螺(7^6ocoro朋""gra"w/"/to)粗酶液的制备方法为将1000g粒嵘螺捣碎，加入1000ml 4。C预 冷的海水，摇动10min,用三层纱布过滤后，将滤液4'C静置24小时，取上清即为粒嵘螺粗 酶液)的小瓶中，用锡纸包裹，放置于26-2『C下酶解，将酶解混合液经筛绢过滤，使块状组 织彻底分离成为单个细胞；将所得单细胞悬液移入离心管中，离心后弃i上清液；收集细胞 沉淀并加入培养液(优选MES培养液，含NaN03 1.4g、 (3-甘油磷酸钠0.2g、 EDTA0.3g、 H3B03 0.25g、 MnCl2*4H20 0.035g、 FeCl3'6H20 12.5mg、 ZnCl2 2.5mg、 CoCl2*6H20 1.0 mg、 Fe'Citrate 6ml和Tris2.0g，然后补加蒸馏水至500ml，调pH至7.6)调成细胞悬浮液，转入细胞培养皿 进行单细胞培养(培养条件为光照5^moHn—V1、温度24'C，光周期12L:12D)，培养60-70天 后，选取具有目标性状表型的雌雄叶状体隔离培养，同时对选取的雌雄叶状体利用微卫星标 记检测与目标性状相连锁的标记，选出在具有目标性状的个体中均含有的带型作为特异的微 卫星标记。2将选取的具有目标性状表型的雄性叶状体和雌性叶状体成对放置于培养瓶中进行杂交， 同时将煮过的牡蛎壳置入培养瓶中，通气培养(培养条件为温度20土rC，光照40pnior m《s"， 光周期12L:12D)15-20大，牡蛎壳表面出现红色藻落后即为F,代丝状体，继续进行培养，待 藻丝布满整个贝壳时，进行孢子囊枝的诱导，随后壳孢子大量释放。2-3天后孢子萌发，形 成壳孢子苗即F,代叶状体。3利用已选微卫星标记(与生长速率和成熟期连锁的分子标记分别为PHM5、 PHM17)对 Fi代叶状体进行分子标记辅助选择，用特异的、与目标性状连锁的SSR标记引物对亲本和子 代个体基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺电泳检测，选取子代中电泳 带型与亲本相同的个体，同时结合目标性状表型的选择，选取含有目标性状的个体。54采用步骤1的单细胞酶解方法，对选出的含有目标性状的个体进行酶解、培养，获得 具有双亲性状的纯合品系。有益效果1本专利技术以杂交组合育种的方式培育坛紫菜的新品系，拓宽了紫菜传统育种中遗传基础相对狭隘的现状，通过杂交组合rr种的方式，有利于实现优良性状的组合。2在选育过程中使用了与生长速率、成熟期连锁的微卫星标记PHM5和PHM17进行辅 助选择，有利于缩短育种周期，提高选择准确性，降低育种规模，从而快速高效实现优良性 状的聚合，培育优良品系。附图说明图1 PHM5在牛长速率快的个体中的扩增情况 图2 PHM17在晚熟个体中的扩增情况；图3 PHM5和PHM17对Fl代11个具有聚合性状个体的扩增情况；*表示选出的具有聚合 性状的个体。具体实施例以下分别以生长速率和成熟期性状作为亲本材料选择的目标性状，以生长速率和成熟期 作为聚合目标性状为实施例进行进一步说明。本专利技术所用到的微卫呈标记除可用现有技术中的微卫呈标记外，优选采用以卜的筛选方法筛选获得坛紫菜的微卫呈标记 1微卫呈富集文库的构建采取常规方法提取条斑紫菜丝状体基因组DNA，取10吗，利用限制性内切酶/foe III和 4/" I对基因组DNA进行酶切，在温度37'C条件下酶切12小时，电泳检测回收500-1500bp 大小的片段。加上接头进行连接，条件为50ng 5'端磷酸化的接头(接头序列为第一链 5'pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA3，；第二链5'CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3')、 l吗酶切片段、20U T4igase(Nevv England BioLab， Inc. )、 2|il ligase buffer(New England 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种坛紫菜分子标记辅助选择育种方法，其包括以下步骤：　（１）将坛紫菜野生资源的贝壳丝状体，置于光照培养箱内进行丝状体光照培养，待藻丝布满整个贝壳时，进行孢子囊枝的诱导；随后壳孢子大量释放，萌发形成壳孢子苗，改变培养条件通气培养３０天后 ，壳孢子苗进一步发育成叶状体；将具有不同性状表型的叶状体放置在单独的培养瓶中隔离培养，培养至性成熟，测定各个体的目标性状表型；　对具有目标性状表型的个体分别进行单细胞酶解，使块状组织彻底分离成为单个细胞；将所得单细胞悬液移入离心管中， 离心后弃去上清液；收集细胞沉淀并加入培养液调成细胞悬浮液，转入细胞培养皿进行单细胞培养，培养６０－７０天后，选取具有目标性状表型的雌雄叶状体隔离培养，同时对选取的雌雄叶状体利用微卫星标记检测与目标性状相连锁的标记，选出在具有目标性状的个体中均含有的带型作为特异的微卫星标记；　（２）将选取的具有目标性状表型的雄性叶状体和雌性叶状体成对放置于培养瓶中进行杂交，将煮过的牡蛎壳置入培养瓶中，通气培养１５－２０天，牡蛎壳表面出现红色藻落后即为Ｆ１代丝状体，采取步骤（１）的方法继续 进行培养，形成壳孢子苗即Ｆ１代叶状体；　（３）利用已选微卫星标记对Ｆ１代叶状体进行分子标记辅助选择，用特异的、与目标性状连锁的ＳＳＲ标记引物对亲本和子代个体基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺电泳检测，选取子代中电泳带 型与亲本相同的个体，同时结合目标性状表型的选择，选取含有目标性状的个体；　（４）采用步骤（１）的单细胞酶解方法，对选出的含有目标性状的个体进行酶解、培养，获得具有双亲性状的纯合品系。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：茅云翔，孔凡娜，王莉，杨惠，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]