希瓦氏菌整合温和噬菌体片段编码的缺口酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及希瓦氏菌整合温和噬菌体片段编码的缺口酶及其应用。本发明专利技术提供了一种新的缺口酶，其来源于希瓦氏菌Shewaenlla oneidensis MR

【技术实现步骤摘要】
希瓦氏菌整合温和噬菌体片段编码的缺口酶及其应用


[0001]本专利技术涉及本专利技术涉及生物
，具体涉及希瓦氏菌整合温和噬菌体片段编码的缺口酶及其应用。

技术介绍

[0002]核酸检测被广泛应用在食品安全、生物医学检测、环境检测等领域。核酸序列特异的等温和聚合酶链式反应(PCR)扩增技术是近年来分子诊断学中蓬勃发展的典型代表。缺口酶可高效替代DNA双链的内切酶，用于快速恒温扩增技术，使等温扩增技术进入一个新的发展阶段并更快地走向实际应用。链置换扩增技术(SDA)是1992年由Walker等人提出，用于快速检测结核分枝杆菌IS6110核酸片段。但其中的HincII切断DNA双链，为了让其只剪切双链中的一条链而获得缺口以保证后续的链置换扩增反应可以顺利进行，只能引入了修饰的底物(dATPαS)以形成修饰的酶切位点来解决这一问题，从而导致该方法成本过高且操作繁琐，极大限制了其广泛应用。而缺口酶仅切断核酸单链，妥善解决HincII产生的核酸双链断裂问题，极大地简化了实验步骤，降低了样品污染的可能性，使该方法在核酸的现场快速检测及即时检测(Point
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of
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care testing,POCT)中更具较强实用前景。基因改造是提高缺口酶活性和切割效率的有效手段之一，但目前可用于生物开发的缺口酶产生菌还不够多，基因改造范围局限，所以挖掘可产缺口酶的产生菌具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供希瓦氏菌整合温和噬菌体片段编码的缺口酶及其应用。
[0004]本专利技术提供了希瓦氏菌在制备缺口酶中的应用。
[0005]进一步的，所述希瓦氏菌为Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)。
[0006]本专利技术通过挖掘，第一次发现希瓦氏菌Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)可产缺口酶，进一步试验发现，所述缺口酶由希瓦氏菌Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)基因组上整合的温和噬菌体片段(SO_0641
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SO_0690)编码，编码基因为SO_0655，为缺口酶供体菌提供了新的物种来源，也进一步丰富了缺口酶的基因来源。
[0007]本专利技术提供了缺口酶，其来源于希瓦氏菌为Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)。
[0008]进一步的，本专利技术的实验中发现希瓦氏菌Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)培养上清具有缺口酶的功能，经过进一步的验证，发现所述希瓦氏菌Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)可产生一种新的未经公开的缺口酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]更进一步的，本专利技术所述的缺口酶有广泛的作用温度(4～55℃)，不仅可以代替现有DNA缺口酶，并且这种广泛的作用温度使其能够用于更多的实验操作和技术中，使其更具有应用价值；同时本专利技术所述的缺口酶与其他缺口酶相比，具有更好的切割性能和/或酶活
力，并且作用效果也具有进一步提升的潜力和空间，为基因工程改造提供了可靠的基因来源。
[0010]本专利技术提供了所述的缺口酶在DNA单链断裂中的应用。
[0011]进一步的，所述DNA单链断裂包括双链DNA中的其中一条单链的断裂，也包括单链DNA的直接断裂，本专利技术的具体实施例中，所述缺口酶为可以使双链DNA中的其中一条单链的断裂。
[0012]本专利技术提供了编码所述缺口酶的核酸，其由希瓦氏菌Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)基因组上整合的温和噬菌体(SO_0641
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SO_0690)片段编码，编码基因为SO_0655。
[0013]进一步的，所述的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，为首次对如SEQ ID NO:1编码的SO_0655蛋白功能进行解析。
[0014]本专利技术提供了缺口酶的制备方法，其为培养希瓦氏菌，获得含有缺口酶的培养物；
[0015]所述希瓦氏菌为Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)。
[0016]进一步的，所述培养的培养基为LB，培养的条件为30℃200rpm/min。
[0017]本专利技术提供了制剂，其包括本专利技术所述的缺口酶或本专利技术所述的制备方法制得的含有缺口酶的混合物中的至少一种和辅料。
[0018]本专利技术中，所述的辅料用于维持所述缺口酶的活性或使所述缺口酶更好的发挥功能，本专利技术中，所述辅料包括稳定剂、抗氧化剂、还原剂和/或缓冲液中的至少一种。
[0019]本专利技术提供了DNA单链断裂的方法，其为利用本专利技术所述的缺口酶或本专利技术所述的制剂对DNA进行切割。
[0020]进一步的，所述切割的温度为4～55℃。
[0021]本专利技术提供了一种新的缺口酶，其来源于希瓦氏菌Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，可使双链DNA的其中一条单链的特定部位产生断裂，该缺口酶作用温度广泛，切割效果好，在核酸等温扩增等领域具有广泛的应用价值。
附图说明
[0022]图1示缺口酶的SDS
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PAGE图，其中，100mM 1为100mM的咪唑洗脱样品1、100mM 2为100mM的咪唑洗脱样品2；300mM 1为300mM的咪唑洗脱样品1，300mM 2为300mM的咪唑洗脱样品2，300mM 3为300mM的咪唑样品3；10mM、20mM、30mM、50mM分别为10mM、20mM、30mM、50mM的咪唑分别洗脱的样品；
[0023]图2示缺口酶功能的验证，其中，OC为open circular DNA，L为linear DNA；CCC为covalently closed circular DNA。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了希瓦氏菌整合温和噬菌体片段编码的缺口酶及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内
对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。
[0025]缺口酶的编码核苷酸序列为：
[0026][0027][0028]缺口酶氨基酸序列为：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.希瓦氏菌在制备缺口酶中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述希瓦氏菌为Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)。3.缺口酶，其特征在于，来源于希瓦氏菌为Shewaenlla oneidensis MR
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1(ATCC 700550)。4.根据权利要求3所述的缺口酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。5.权利要求3或4所述的缺口酶在DNA单链断裂中的应用。6.编码权利要求3或4所述缺口酶的核酸。...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓晓，顾兵，赵云虎，张妮，凌勇，袁凯旋，崔善钊，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：