创伤弧菌的特异性分子靶标及其检测方法技术

本发明专利技术公开了创伤弧菌的特异性分子靶标及其检测方法，所述特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。本发明专利技术不仅公开了用于鉴别创伤弧菌的四个特异性分子靶标，还提供了相关的特异性引物序列，以及相对应的PCR检测方法。本发明专利技术无需经过生理生化鉴别，具有检测时间短、成本低、特异性强等优点。特异性强等优点。特异性强等优点。

【技术实现步骤摘要】
创伤弧菌的特异性分子靶标及其检测方法


[0001]本专利技术涉及细菌检测技术，具体地说，涉及一种创伤弧菌的特异性分子靶标及其检测方法。

技术介绍

[0002]创伤弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性的致病性海洋细菌，菌体大小为0.7
×
2~3.5μm。它的生长温度为15℃~27℃、盐度为0.7%~1.6%的海水或盐湖中，常常存在于温暖的沿海地区，夏季是创伤弧菌感染的多发期，尤其是具有亚热带季风性气候的地区特别容易出现弧菌科的增殖。该细菌会通过食用受污染的海鲜、伤口直接接触受污染的水或海鲜来感染人类宿主，从而导致败血症、严重伤口感染和胃肠炎。虽然感染率低，但如果未能及时识别和治疗这种感染，会导致高发病率和死亡率。创伤弧菌常常存活于浮游生物和贝类上，比如牡蛎。如果对这种细菌敏感的人在生牡蛎中摄入该菌，会导致约为60%的死亡率。随着全球气候变暖，创伤弧菌在淡水环境中不断生长，陆生动植物和昆虫会接触创伤弧菌并可能成为传播疾病的载体。因此，我们需要准确的检测手段，来降低由创伤弧菌引起的食物中毒事件的出现。
[0003]目前，对于创伤弧菌的检测，传统的检测方法是平板培养法。具有成本低、特异性强等优点，但同时平板培养计数法也有一些缺点，例如培养时间长、操作繁琐、对操作人员和操作过程要求较为严格等。为了弥补平板检测法的不足，基于核酸扩增的分子学检测方法已经应用于食品中创伤弧菌的检测中。
[0004]基于核酸扩增的分子学检测方法的特异性与灵敏度主要取决于相应检测靶点的选择。目前，PCR检测方法是最常用的分子学检测方法之一，其引物是根据目标细菌基因组DNA特异性保守序列（检测靶点）进行设计的，因此检测靶点与引物，对于PCR检测的准确性和敏感程度来说是至关重要的。
[0005]使用PCR技术检测创伤弧菌的过程中，许多研究机构和学者仍沿用早期发现的基因作为创伤弧菌检测的靶点，如16S rDNA和vvhA基因。但目前已有相关研究证明，16S rDNA核酸序列与纳瓦拉弧菌（Vibrio navarrensis）的一致性高达96%，与33株其它弧菌的也有90%以上相似的核酸序列；而vvhA基因作为创伤弧菌的特异性基因，也有研究人员发现，以vvhA基因为靶点进行PCR检测创伤弧菌时，对于具有相同致病能力的vvhA基因突变株却无法检测出来，说明目前现有的创伤弧菌特异性检测靶点不能够满足基于核酸检测技术的特异性要求。
[0006]因此，迫切需要系统的、全面的挖掘特异性检测新标靶，从而提高创伤弧菌PCR检测技术的准确性。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，采用泛基因组学技术，对创伤弧菌的核心基因和附属基因进行了全面分析，进而对核心基因部分进行BLAST分析，进一步锁定核心
基因中的特异性基因区域，从而提供一种创伤弧菌的特异性分子靶标及其检测方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于检测创伤弧菌的特异性分子靶标，所述特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
[0009]本专利技术还提供了一组检测上述特异性分子靶标的引物，特异性分子靶标SEQ ID NO.1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；特异性分子靶标SEQ ID NO.2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；特异性分子靶标SEQ ID NO.3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；特异性分子靶标SEQ ID NO.4的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；本专利技术还提供了上述的分子靶标在制备检测创伤弧菌试剂中的应用。
[0010]本专利技术还提供了检测创伤弧菌的试剂盒，包括上述的全部核苷酸序列。
[0011]本专利技术还提供了一种非疾病诊断治疗目的的检测创伤弧菌的方法，包括以下步骤：（1）提取待检测微生物的DNA，以提取的DNA为模板，采用上述的引物对其进行PCR扩增；（2）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果出现目标大小的条带（154bp，288bp，341bp或427bp），则判定样品中含有创伤弧菌，若电泳结果未出现目标大小的条带（154bp，288bp，341bp或427bp）则判定样品中不含有创伤弧菌。
[0012]作为优选的，在上述的检测创伤弧菌的方法中，所述PCR扩增的反应体系为20微升，其中包括10
ꢀµ
L 2
×ꢀ
PCR Mix，2
µ
L模板DNA，10
µ
M的上下游引物。
[0013]作为优选的，在上述的检测创伤弧菌的方法中，所述PCR扩增的反应条件为95℃预变性3 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30s，共计35轮循环，72℃延伸5 min，4℃保持。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果。本专利技术公开了用于鉴别创伤弧菌的四个特异性分子靶标，并提供相关的特异性引物序列，以及相对应的PCR检测方法。本专利技术无需经过生理生化鉴别，具有检测时间短、成本低、特异性强等优点。
附图说明
[0015]图1为具体实施方式中创伤弧菌VV
‑
1引物对灵敏度结果验证图。
[0016]注：泳道M：DL1200 DNA Marker；泳道1
‑
7按照梯度递增：1.94
ꢀ×ꢀ
101–ꢀ
1.94
ꢀ×ꢀ
107CFU/mL；泳道N：阴性对照；图2为具体实施方式中创伤弧菌VV
‑
2引物对灵敏度结果验证图。
[0017]注：泳道M：DL1200 DNA Marker；泳道1
‑
7按照梯度递增：1.94
ꢀ×ꢀ
101–ꢀ
1.94
ꢀ×ꢀ
107CFU/mL；泳道N：阴性对照；图3为具体实施方式中创伤弧菌VV
‑
3引物对灵敏度结果验证图。
[0018]注：泳道M：DL1200 DNA Marker；泳道1
‑
7按照梯度递增：1.94
ꢀ×ꢀ
101–ꢀ
1.94
ꢀ×ꢀ
107CFU/mL；泳道N：阴性对照；图4为具体实施方式中创伤弧菌VV
‑
4引物对灵敏度结果验证图。
[0019]注：泳道M：DL1200 DNA Marker；泳道1
‑
7按照梯度递增：1.94
ꢀ×ꢀ
101–ꢀ
1.94
ꢀ×ꢀ
107CFU/mL；泳道N：阴性对照；图5为具体实施方式中创伤弧菌VV
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1引物对特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测创伤弧菌的特异性分子靶标，其特征在于所述特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。2.一组检测如权利要求1所述的特异性分子靶标的引物，其特征在于，特异性分子靶标SEQ ID NO.1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；特异性分子靶标SEQ ID NO.2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；特异性分子靶标SEQ ID NO.3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；检测特异性分子靶标SEQ ID NO.4的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。3.权利要求1所述的分子靶标在制备检测创伤弧菌试剂中的应用。4.一种检测创伤弧菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2所述的全部核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶蕾，吕新瑞，徐洁茹，张依琳，张璜，石磊，白卫滨，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：