一种猫源犬支原体分离株cynos-37制造技术

本发明专利技术属于动物传染病防制技术领域，并提供了猫源犬支原体分离株cynos

【技术实现步骤摘要】
一种猫源犬支原体分离株cynos
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37


[0001]本专利技术属于动物传染病防制
，并提供了猫源犬支原体分离株cynos
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37。

技术介绍

[0002]犬传染性呼吸道疾病(Canine infectious respiratory disease,CIRD)，也被称为犬窝咳，是一种可由多种细菌或病毒诱发的复杂疾病，如犬支原体(M.cynos)、支气管败血波氏杆菌、犬流感病毒、犬副流感病毒、犬呼吸道冠状病毒等。支原体通常作为共生生物或条件性致病微生物存在植物、哺乳动物、爬行动物、鸟类和昆虫中，由于基因组小且缺乏细胞壁，代谢能力有限，因此它们很脆弱，难以分离培养。自M.cynos于1973年首次分离以来，在健康犬和患病犬的呼吸道和泌尿生殖道都有发现，并于肺部病变灶分离到该病原。目前已有研究和病例证实了M.cynos与CIRD之间的联系，且感染M.cynos会增加犬只对其他呼吸道病原的易感性，对犬只的健康具有重大的潜在威胁。但此前尚未发现M.cynos感染猫的病例。

技术实现思路

[0003]本专利技术首次在猫上检测并分离到与M.cynos高度同源的支原体分离株，表明M.cynos可能存在跨物种传播的风险。
[0004]为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0005]申请人2021年用无菌棉拭子采集湖北省武汉市江夏区猫舍疑似支原体感染猫的眼鼻拭子，将此分离株命名为猫源犬支原体分离株cynos
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37，2023年3月23日送交中国典型培养物保藏中心(武汉大学)进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：V202317，分类名称为：支原体cynos
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37株Mycoplasma cynos
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37。将该支原体阳性拭子进行纯化和培养，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取纯化培养支原体的DNA为模板，使用引物PCR扩增16S rDNA，扩增产物提交至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，具体序列如SEQ ID NO：1所示。将所分离菌株测序结果与GenBank中进行blast比较，结果显示：猫源犬支原体分离株cynos
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37与M.cynos位于同一分支。该支原体可用于制备猫源犬支原体抗体的检测试剂盒。
[0006]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0007]1.分离株cynos
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37的16S基因序列为申请人首次发现的猫源犬支原体16S核糖体。
[0008]2.本专利技术的分离株cynos
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37的16S基因序列与M.cynos序列高度同源，可作为猫源犬支原体或其抗体检测的分子靶标。
附图说明
[0009]图1为分离株经过培养后于显微镜下观察到的结果；
[0010]图2为分离株的电镜观察结果；
[0011]图3为分离株的PCR鉴定结果(泳道1为DL2000 Marker，泳道2为阳性对照，泳道3为阴性对照，泳道4为分离毒株的扩增产物)；
[0012]图4为分离株的16S基因序列的同源性分析；
[0013]图5为分离株的16S基因序列的进化树分析；
[0014]图6为携带有该支原体猫的剖检结果(A为支原体阳性猫临床面部图片，B为支原体阳性猫第三眼睑，C为支原体阳性猫肺脏)；
[0015]图7为携带有该支原体猫的肺脏连同气管细胞切片结果(A为气管的病理切片结果，B为肺的病理切片结果)；
[0016]图8为分离株的增殖曲线；
[0017]图9为分离株感染试验犬后眼睛存在浆液性分泌物的图片(A为1号感染支原体犬临床面部图片，B为2号感染支原体犬临床面部图片，C为3号感染支原体犬临床面部图片，D为1号感染支原体犬眼睑存在浆液性分泌物图片，E为2号感染支原体犬眼睑存在浆液性分泌物图片，F为3号感染支原体犬眼睑存在浆液性分泌物图片，G为4号未感染支原体犬临床面部图片，H为5号未感染支原体犬临床面部图片，I为6号未感染支原体犬临床面部图片)；
[0018]图10为分离株感染试验犬的体温趋势图；
[0019]图11为分离株感染试验犬的体重趋势图；
[0020]图12为分离株感染试验犬死亡后剖检的第三眼睑红肿和肺脏充血、坏死结果(A为攻毒试验组第三眼睑，B为对照试验组第三眼睑，C为攻毒试验组肺脏，D为对照试验组肺脏)；图13为分离株灭活免疫、攻毒后试验犬的临床症状(左图A为免疫攻毒试验组犬，右图B为未免疫攻毒试验组犬)
[0021]图14为分离株灭活免疫、攻毒后试验犬的每日体温趋势图；
[0022]图15为分离株灭活免疫、攻毒后剖检的第三眼睑和肺脏肉眼观察图片(A为免疫攻毒试验组第三眼睑，B为未免疫试验组第三眼睑，C为免疫攻毒试验组肺脏，D为未免疫试验组肺脏)；
[0023]图16为分离株灭活免疫、攻毒后剖检试验犬的气管组织病理切片结果(A为免疫攻毒试验组犬气管病理切片，B为未免疫试验组犬气管病理切片)；
[0024]图17为分离株灭活免疫、攻毒后剖检试验犬的肺脏组织病理切片结果(A为免疫攻毒试验组犬肺脏病理切片，B为未免疫试验组犬肺脏病理切片)；
[0025]图18为分离株灭活免疫、攻毒后剖检试验犬的第三眼睑组织病理切片结果(A为免疫攻毒试验组犬第三眼睑病理切片，B为未免疫试验组犬第三眼睑病理切片)。
具体实施方式
[0026]实施例1菌株的分离和鉴定
[0027]1.样品的采集与处理
[0028]2021年用无菌棉拭子采集湖北省武汉市江夏区猫舍疑似支原体感染猫的眼鼻拭子。
[0029]2.PCR鉴定
[0030]用细菌基因组DNA提取试剂盒提取拭子的DNA并以其为模板，设计引物利用PCR方法鉴定犬支原体，扩增片段大小为478bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0031]表1引物序列
[0032][0033]表2PCR反应体系
[0034][0035]表3PCR反应程序
[0036][0037]产物扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，培养物提取DNA经PCR扩增后使用琼脂糖凝胶电泳检测，待检病料或培养物均在250bp～500bp之间接近500bp的位置有一条带，与预期478bp相符，将此分离株命名为支原体cynos
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37株Mycoplasma cynos
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37，2023年3月23日送交中国典型培养物保藏中心(武汉大学)进行保藏，保藏编号为CCTCC:V202317。
[0038]3.支原体的纯化与分离培养：将支原体阳性拭子在超净台内接种至支原体改良液体培养基，37℃静置培养，每日测定培养液的pH值。培养液变色时，取第一代经0.45μm过滤器过滤后的培养物0.5mL接种至5mL含青霉素2000U/mL的改良支原体液体培养基中，于37℃条件继续培养。培养基变黄后，直接取培养物涂布支原体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫源犬支原体分离株cynos
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37，保藏编号为CCTCC:V202317。2.权利要求1所述的一种猫源犬支原体分离株cynos
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37，其16S rDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秋燕，周登元，王同兆，叶子俊，陈清秀，肖贵发，徐高原，钟鸣，王莹，杜苏兰，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：