唾液酸化HMO生产中的新主要易化子超家族（MFS）蛋白（FRED）制造技术

本发明专利技术涉及在遗传修饰细胞中重组生产生物分子的领域。更具体地，本发明专利技术涉及使用表达主要易化子超家族(MFS)蛋白质的遗传修饰细胞重组生产唾液酸化人乳寡糖(HMO)的方法，所表达的蛋白质是Fred。达的蛋白质是Fred。达的蛋白质是Fred。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】唾液酸化HMO生产中的新主要易化子超家族(MFS)蛋白(FRED)


[0001]本专利技术涉及在遗传修饰细胞中重组生产生物分子的领域。更具体地，本专利技术涉及使用表达主要易化子超家族(MFS)蛋白质的遗传修饰细胞重组生产唾液酸化人乳寡糖(HMO)的方法，所表达的蛋白质是Fred。

技术介绍

[0002]人乳寡糖(HMO)是不可消化的碳水化合物，是母乳的第三大成分。与人类母乳相比，没有其他哺乳动物具有类似浓度或复杂性的不可消化低聚糖。迄今为止，已鉴定出200多种HMO(参见XI Chen,Chapter 4of Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry,2015,Volume 72和Urashima等人:Milk Oligosaccharides,Nova Biomedical Books,New York,2011,ISBN:978
‑1‑
61122
‑
831
‑
1)。
[0003]由于发现了HMO在人类发育中的重要功能，因此在过去十年中HMO引起了人们的极大兴趣。除了其益生元特性外，HMO还具有其他积极作用，从而扩大了其应用领域(Kunz C.等人,(2014)Food Oligosaccharides:Production,Analysis and Bioactivity,1st Edition,p 5
‑
20,Eds.Moreno J.and Luz Sanz M.,John Wiley&Sons,Ltd)。HMO的健康益处使其被批准用于食品(例如婴儿配方奶粉和食品)以及消费者保健产品。
[0004]HMO可以化学合成；然而，这对大规模生产提出了挑战。为了克服与HMO化学合成相关的挑战，已经开发了若干酶法和发酵方法。已经针对多种HMO，例如2
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岩藻糖基乳糖、3
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岩藻糖基乳糖、乳
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N
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四糖、乳
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N
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新四糖、3
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唾液酸乳糖和6
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唾液酸乳糖开发了基于发酵的方法。基于发酵的方法通常利用基因改造的细菌菌株，例如重组大肠杆菌(E.coli)(有关综述，请参阅Bych等人,Current Opinion in Biotechnology 2019,56:130
‑
137)。
[0005]HMO生物技术生产的最新发展使得克服细菌表达系统的某些固有局限性成为可能。例如，可以对产生HMO的细菌细胞进行基因修饰，以增加细菌中有限的细胞内核苷酸糖库(WO2012/112777)，以提高参与HMO产生的酶的活性(WO2016/040531)，或促进将合成的HMO分泌到细胞外介质中(WO2010/142305、WO2017/042382)。此外，重组细胞中目的基因的表达可以通过使用特定的启动子或其他基因表达调节子来调节，例如如WO2019/123324中所描述的。
[0006]糖流出转运蛋白的使用已在WO2010/142305和WO2017/042382中描述，并且具有通过产生高水平的HMO并允许HMO在生产过程中离开细胞而减少对细胞造成的代谢负担的优点。这种方法在重组HMO生产细胞工程中引起了越来越多的关注，例如，最近描述了几种新的糖转运蛋白基因编码蛋白和发酵过程，其可以促进重组生产的2
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岩藻糖基乳糖(2
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FL)这种人母乳中最丰富的HMO的流出(WO2018/077892、US2019/00323053、US2019/00323052)。
[0007]唾液酸化HMO的生产已在WO2007/101862中描述，其描述了从微生物生产例如3
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SL所需的修饰。由于唾液酸部分的酸性，唾液酸化HMO的产生导致细胞酸化，而由于细胞酸化的生理影响，这又导致总体生产结果不太有利。因此，增强特别是唾液酸化HMO从细胞中的输出将为细胞带来生理学益处，同时还简化唾液酸化HMO的下游收获和纯化，总体而言对
于唾液酸化HMO的大规模生产具有巨大益处。
[0008]然而，目前还没有算法能够在多个蛋白质数据库(例如UniProt)中具有预测转运蛋白功能的众多细菌蛋白中精准确定能够流出不同重组产生的HMO结构的正确转运蛋白，因为定义糖转运蛋白底物特异性的结构
‑
功能关系尚未得到充分研究，并且仍然高度不可预测。
[0009]本公开首次展示了特定异源糖流出转运蛋白在唾液酸化HMO生产菌株中用于提高生产的产品量以及其他有利的生产益处的用途。

技术实现思路

[0010]最近，本申请的专利技术人已经鉴定了主要易化子超家族(MFS)中的几种能够转运其他HMO例如3
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FL、LNT、LNT
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II、LNnT和LNFP
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I的转运蛋白(WO2021/148615和WO2021/148614和WO2021/148611和WO2021/110610和PCT/EP2021/0514662和WO2021/148620和WO2021/148618)。本公开首次展示了异源糖流出转运蛋白Fred在唾液酸化HMO生产菌株中用于获得有利的生产效益的用途。
[0011]本公开表明，异源基因fred(编码来自主要易化子超家族(MFS)的Fred蛋白)在产生唾液酸化HMO的菌株中的过表达增加了从细胞输出的HMO的量，而不影响HMO的总体生产。鉴定对不同重组产生的HMO具有特异性的新型有效糖流出转运蛋白以及开发表达所述蛋白的重组细胞对于大规模工业HMO制造是有利的。
[0012]产生的HMO可以包括一个或多个唾液酸部分。在这方面，产生的HMO可选自3
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SL(3
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唾液酸乳糖)、6
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SL(6
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唾液酸乳糖)、LSTc(唾液酸乳
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N
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新四糖c)、LSTa(唾液酸乳
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N
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四糖a)、LSTb(唾液酸乳
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N
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四糖b)、3
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S,3
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FL(唾液酸
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岩藻糖基乳糖)和DS
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LNT(二唾液酸乳
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N
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四糖)。特别地，3
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SL和6
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SL令人感兴趣，因为它们是最丰富的唾液酸化HMO。
[0013]因此，本专利技术涉及能够产生一种或多种唾液酸化人乳寡糖(HMO)的遗传修饰细胞，其中所述遗传修饰细胞包括编码SEQ ID NO:1的主要易化子超家族(MFS)多肽或其功能同源物的异源核酸序列，所述功能同源物具有与SEQ ID NO:1超过70％同一性，例如与S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种能够产生一种或多种包括唾液酸部分的人乳寡糖(HMO)的遗传修饰细胞，其中所述遗传修饰细胞包括，(i)编码SEQ ID NO:1的主要易化子超家族(MFS)多肽或其氨基酸序列与SEQ ID NO:1同一性为至少70％的功能同源物的异源核酸序列，和(ii)编码唾液酸转移酶的异源核酸序列；和(iii)用于制造唾液酸糖核苷酸的生物合成途径。2.根据权利要求1所述的遗传修饰细胞，其中所产生的一种或多种HMO选自3
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SL、6
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SL、FSL、DS
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LNT、LSTc、LSTa和LSTb。3.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰细胞，其中与没有MFS多肽的细胞相比，SEQ ID NO:1的所述MFS多肽或其功能同源物的表达导致所述HMO的输出增加。4.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰细胞，其中所述唾液酸转移酶选自α
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2,3
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唾液酸转移酶和α
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2,6
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唾液酸转移酶，例如表2中呈现的那些。5.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰细胞，其中所述α
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2,3
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唾液酸转移酶选自Nst(SEQ ID NO:3)或Pd2(SEQ ID NO:4)和/或其氨基酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4同一性为至少70％的功能同源物。6.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰细胞，其中所述唾液酸糖核苷酸是CMP
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Neu5Ac。7.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰细胞，其中用于制造唾液酸糖核苷酸的生物合成途径由以下编码：SEQ ID NO:17的neuBCA基因簇，或一个或多个异源基因：SEQ ID NO:12的NeuB和SEQ ID NO:14的NeuC和SEQ ID NO:16的NeuA，或其核酸序列与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16同一性为至少80％的功能同源物。8.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰细胞，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：格礼卡姆股份公司，
类型：发明
国别省市：