一种链置换混合序列及其在cDNA末端快速扩增中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种链置换混合序列及其在cDNA末端快速扩增中的应用。本发明专利技术首先公开了一种链置换混合序列，其由TSO

【技术实现步骤摘要】
一种链置换混合序列及其在cDNA末端快速扩增中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
更具体地，涉及一种链置换混合序列及其在cDNA末端快速扩增中的应用。

技术介绍

[0002]cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)是一种RT
‑
PCR技术，旨从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端。RACE技术的难点在于获得全长cDNA的同时，也要降低非目的基因片段的扩增。
[0003]为了得到完整的mRNA 3'端信息，往往利用mRNA 3'端的腺苷酸尾巴设计dT
N
‑
VN引物来锚定反转录的起始位置。当反转录进行到mRNA 5
’
端时，M
‑
MLV逆转录酶通常会在cDNA一链末端添加2
‑
5个无模板的C。基于此原理，诞生了SMART(Switching Mechanism At 5
’
end of the RNA Transcript)技术，此技术在2012年由美国和瑞典的科学家们共同开发。SMART技术中加入模板转换寡核苷酸(TSO)，它的3
’
端携带了两个核糖鸟苷和一个锁核酸修饰鸟苷。在第一链反应后，利用有限的循环扩增出全长cDNA，此即为5'RACE的PCR模板。
[0004]市面上现有RACE试剂盒主要是基于SMART技术来获得全长cDNA，但其对应的TSO序列却因其5
’
端没有封闭和修饰而导致产生多个TSO序列串联的cDNA产物，使得RACE产物有强烈的非特异扩增信号。需要对TSO序列进行改进。专利CN111549025B中在逆转录mRNA时所使用的链置换引物的5
’
末端带有3个dSpacer修饰，且所述链置换引物带有长度为4的随机序列；专利CN108103055B对应的TSO序列为“5
’‑
GCTCTTCCGATCTKKNNNNNNrGrG+G
‑3’”
，并在5
’
端以AMO修饰。以上两个专利均是为了实现高效的mRNA 5
’
端锚定序列的添加，但因MMLV酶在cDNA一链末端添加的C的数量是不固定的，因此，单纯的封闭修饰或空间位阻修饰无法完全避免多轮反转录后cDNA末端TSO序列的串联。为了给RACE反应提供单一的PCR模板，针对TSO序列5
’
端的修饰仍需要进一步加强。
[0005]因此，需要对TSO序列进一步改进以有效提高反转录的效率。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个目的在于提供一种链置换混合序列，其能有效地对5
’
端进行封闭，且降低非特异序列的串联。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供上述链置换混合序列在cDNA末端快速扩增中的应用。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0009]本专利技术首先提供了一种链置换混合序列，该链置换混合序列由TSO
‑
1、TSO
‑
2、TSO
‑
3、TSO
‑
4、TSO
‑
5和TSO
‑
6共6条链置换引物组成；所述6条链置换引物在SEQ ID NO.1所示的序列的5
’
端进行3
‑
5个iso
‑
dG以及NHS
‑
Carboxy C10(简称为NHS
‑
CO
‑
C10)或Amino Modifier C6(简称为AmC6)修饰，同时在其3
’
端进行rGrG+G修饰，所述rGrG+G代表2个核糖鸟苷(rG)和一个LNA修饰的鸟苷(+G)。
[0010]进一步，所述6条链置换引物分别为：
[0011]所述TSO
‑
1的序列为5
’‑
/NHS
‑
CO
‑
C10//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG/AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCC/rGrG+G/
‑3’
，在SEQ ID NO.1所示的序列的5
’
端进行5个iso
‑
dG以及NHS
‑
CO
‑
C10修饰，同时在其3
’
端进行rGrG+G修饰；
[0012]所述TSO
‑
2的序列为5
’‑
/NHS
‑
CO
‑
C10//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG/AA GCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCC/rGrG+G/
‑3’
，在SEQ ID NO.1所示的序列的5
’
端进行4个iso
‑
dG以及NHS
‑
CO
‑
C10修饰，同时在其3
’
端进行rGrG+G修饰；
[0013]所述TSO
‑
3的序列为5
’‑
/NHS
‑
CO
‑
C10//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG/AAGCAG TGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCC/rGrG+G/
‑3’
，在SEQ ID NO.1所示的序列的5
’
端进行3个iso
‑
dG以及NHS
‑
CO
‑
C10修饰，同时在其3
’
端进行rGrG+G修饰；
[0014]所述TSO
‑
4的序列为5
’‑
/AmC6//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG/AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCC/rGrG+G/
‑3’
，在SEQ ID NO.1所示的序列的5
’
端进行5个iso
‑
dG以及AmC6修饰，同时在其3
’
端进行rGrG+G修饰；
[0015]所述TSO
‑
5的序列为5
’‑
/AmC6/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种链置换混合序列，其特征在于，所述链置换混合序列由TSO
‑
1、TSO
‑
2、TSO
‑
3、TSO
‑
4、TSO
‑
5和TSO
‑
6共6条链置换引物组成；所述6条链置换引物在SEQ ID NO.1所示的序列的5
’
端分别进行3
‑
5个iso
‑
dG以及NHS
‑
CO
‑
C10或AmC6修饰，同时在其3
’
端进行rGrG+G修饰。2.根据权利要求1所述的链置换混合序列，其特征在于，所述6条链置换引物分别为：所述TSO
‑
1的序列为5
’‑
/NHS
‑
CO
‑
C10//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG/AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCC/rGrG+G/
‑3’
，在SEQ ID NO.1所示的序列的5
’
端进行5个iso
‑
dG以及NHS
‑
CO
‑
C10修饰，同时在其3
’
端进行rGrG+G修饰；所述TSO
‑
2的序列为5
’‑
/NHS
‑
CO
‑
C10//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG/AA GCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCC/rGrG+G/
‑3’
，在SEQ ID NO.1所示的序列的5
’
端进行4个iso
‑
dG以及NHS
‑
CO
‑
C10修饰，同时在其3
’
端进行rGrG+G修饰；所述TSO
‑
3的序列为5
’‑
/NHS
‑
CO
‑
C10//iso
‑
dG//iso
‑
dG//iso
‑
dG/AAGCAG TGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCC/rGrG+G/
‑3’
，在SEQ ID NO.1所示的序列的5
’
端进行3个iso
‑
dG以及NHS
‑
CO
‑
C10修饰，同时在其3
’
端进行rGrG+G修饰；所述TSO
‑
4的序列为5
’‑
/AmC6//iso
‑
dG//iso
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘凤麟，宋新文，卜祥潘，耿亮，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：