检测三种猪病毒性腹泻病原的引物组，试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了检测三种猪病毒性腹泻病原的引物组，试剂盒及方法，建立了基于侧流层析试纸条的多重环介导等温扩增技术，能够同时检测PEDV、PoRV和PBoV。通过针对高度保守的PEDV gp6基因、PoRVvp6基因和PBoV vp1基因设计特异性LAMP引物，并分别在三对环引物的5

【技术实现步骤摘要】
检测三种猪病毒性腹泻病原的引物组，试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于病原体检测
，涉及猪病毒性腹泻病原体的检测，尤其涉及一种基于侧流层析试纸条的多重环介导等温扩增的多重多重LAMP
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LFD检测三种猪病毒性腹泻病原的引物组，试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]猪肉长期以来都是人们日常生活中最重要的肉类食品和补充动物蛋白最主要的来源。随着生猪养殖规模的扩大，猪疫病的发生频率也越来越高。目前，猪病毒性腹泻是仔猪高发病率和高死亡率的主要原因，给世界各地养殖场造成了巨大的经济损失。其中，猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)和猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)的混合感染，给猪腹泻病原的鉴定与诊断带来很大困难。
[0003]猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性消化道(肠道)传染病，可引起仔猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。PEDV是一种具有包膜的正义单链RNA病毒，其基因组大小约为28K，属于冠状病毒科(Coronaviridae)、甲型冠状病毒属(Alphacoronavirus)。PEDV基因组能够编码4种结构蛋白(刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N))和16种非结构蛋白(NSP)。其中，核衣壳蛋白作为结构蛋白之一，在病毒粒子形成、病毒组装和细胞应激反应中发挥重要作用。目前，可以编码核衣壳蛋白的gp6基因已被用作PEDV检测和治疗的靶点。
[0004]猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)是引起仔猪病毒性腹泻的主要病毒之一，其临床症状具体表现为仔猪精神烦躁、呕吐、厌食、腹泻甚至死亡。PoRV是一种无包膜的双链RNA病毒，属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属，其基因组可以编码6种结构蛋白(viral structural protein,VP)和6种非结构蛋白(non
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structural protein,NSP)，其中VP6组成了病毒内衣壳蛋白，在病毒粒子中含量最丰富，既能维持病毒粒子稳定，又能在病毒复制、装配过程中起到重要作用。研究表明，尽管轮状病毒(Rotavirus,RV)在演化过程中分出了多种G型与P型，但vp6基因在不同分型之间高度保守
[39]，可以用作PoRV检测的候选靶标。
[0005]猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)是近年来新发现的一种能够引起感染猪只肠道和呼吸系统疾病的病毒，受感染猪只在临床上表现为食欲不振，呕吐、腹泻甚至死亡。PBoV是一种无囊膜的单链线性DNA病毒，属于细小病毒科(Parvoviridae)、博卡病毒属(Bocaparvovirus)。其病毒基因组可以转录翻译4种蛋白质VP1、VP2、NS1和NP1，其中VP1蛋白分布于病毒衣壳的外层，在病原入侵过程中发挥重要作用。编码VP1蛋白的基因组长度约2.1kb，其5
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端包含一段独有的保守序列
‑“
YXGXF”结构域，对病毒DNA进入细胞核这一过程十分关键。目前，已有研究选择vp1基因作为PBoV鉴定靶标。
[0006]目前用于实验室检测猪腹泻相关病原的方法包括病毒分离法、免疫学方法和分子生物学方法。其中病毒分离法和免疫法较难满足现场即时检验的需求，往往耗时较长，准备
工作较繁琐。
[0007]聚合酶链式反应技术(Polymerase Chain Reaction,PCR)因灵敏度高、特异性强等优点，成为检测猪腹泻相关病原的重要手段。尽管常规PCR和多重RT
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PCR已经能够满足大多数病毒检测的需求，但后续为验证扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳耗费了较多时间，且琼脂糖凝胶电泳较难摆脱实验室环境，不适于野外检测或大规模现场检测。随着检测需求的不断提高，核酸等温扩增法应运而生。
[0008]其中，环介导等温扩增技术(Loop
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mediated isothermal amplification,LAMP)可在60
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65℃下反应30
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60min将痕量核酸模板扩增到可检测水平。由于LAMP反应快速高效、操作简单、灵敏度高、特异性强且不依赖特殊仪器，十分适用于现场大规模即时检测。当LAMP与侧流层析试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)结合，在胶体金读数仪的辅助下，可实现可视化检测和半定量检测。
[0009]然而，由于猪腹泻相关病原常呈混合感染，给疾病的鉴别与诊断带来了极大的困难,单一的病原检测方法已经难以满足现代化快速检测的需求

技术实现思路

[0010]本专利技术建立了基于侧流层析试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)的多重环介导等温扩增(Loop
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mediated isothermal amplification,LAMP)技术，能够同时检测PEDV、PoRV和PBoV。通过针对高度保守的PEDV gp6基因、PoRVvp6基因和PBoV vp1基因设计特异性LAMP引物，并分别在三对环引物的5
’
端标记不同的荧光基团以区分扩增子，最后结合侧流层析试纸条技术，达到多重检测的目的。优化后的多重LAMP
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LFD检测体系可以使用小巧的微型金属浴在64℃下恒温反应30min完成扩增，扩增产物可以通过侧流层析试纸条在30
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60s内呈现可视化结果。为了满足定量检测的需求，可以辅助以便携的胶体金试纸定量分析仪进行读数分析。优化后的多重LAMP
‑
LFD检测体系具有良好的特异性，只能检出PEDV，PoRV和PBoV三个靶标，与其他病毒不存在交叉反应。同时，该检测体系表现出较高的灵敏度，对PEDV、PoRV和PBoV的检测限可以分别达到2.40
×
101copies/μL、2.89
×
101copies/μL和2.52
×
101copies/μL。在用于实际样品检测时，多重LAMP
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LFD方法检测结果与qPCR检测结果呈现较好的一致性，表明该方法学诊断结果可靠，能够满足实际样本的检测需求。
[0011]本专利技术建立的能够同时检测PEDV、PoRV和PBoV的多重LAMP
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LFD检测技术具有快速、灵敏、可视化、操作简单等优点，为猪腹泻病原现场检测提供了新手段。
[0012]首先，本专利技术提供了检测PEDV、PoRV和PBoV的引物对，探针以及荧光基团。
[0013]其次，本专利技术提供了包含上述引物对，探针，荧光基团的试剂盒。
[0014]最后，本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测三种猪病毒性腹泻病原的引物组，其特征在于，三种猪病毒性腹泻病原分别为猪流行性腹泻病毒PEDV，猪轮状病毒PoRV与猪博卡病毒PBoV；所述引物组序列如下所示：猪流行性腹泻病毒PEDV：F3：GGTACTTGCAAACAACGCTG；B3：TCTTTGCGCCTTCTTTAGCA；FIP：TCAATTCGCTCACCACGGCGTTTTCAAGGGGAATAAGGACCAGC；BIP：ACTACCTCGGAACAGGACCTCATTTTACCCAGAAAACACCCTCAGT；LF：AGCGAATTTGCTCATTCCAGTA；LB：GACCTCCGTTATAGGACTCGT；猪轮状病毒PoRV：F3：CATGCTACTGTCGGACTT；B3：CAAGTTATCTTCTCTTGAAGGT；FIP：GCCGTTACATTTGCCAATAAAGTTTTTTTGAACTGAATCTGCAGTTTGT；BIP：TTCGTCAGGAATATGCTATACCAGTTTTTGAATAATTGGTAACCAGCTCTG；LF：CGTCCGCAAGCACAGATTC；LB：GACCAGTATTTCCACCAGGTATG；猪博卡病毒PBoV：F3：CAACACCACAGTCGGGTAAC；B3：TTTCCCTCCCCCATCTGG；FIP：GCTCTGGACGCCAATTCTTGGTTTTTATTTACGCAACGGGACAAGT；BIP：GCAACAAGATGAGAGCCGACGTTTTTGGCATGGTTTCGTAGTAGCT；LF：TCCCATTCAATTTCGCAGGAG；LB：TACAAAATCAACGCCGATGGAGGAT。2.根据权利要求1所述的检测三种猪病毒性腹泻病原的引物组，其特征在于，PEDV下游环引物LB标记Digoxin，PoRV下游环引物LB标记ROX，PBoV下游环引物LB标记Cy5，三者上游环引物LF均标记Biotin。3.检测三种猪病毒性腹泻病原的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组与侧流层析试纸条，所述侧流层析试纸条由样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫组成，NC膜上分别设有T1测试线，T2测试线，T3测试线与C质控线。4.根据权利要求3所述的检测三种猪病毒性腹泻病原的试剂盒，其特征在于，T1测试线1包被0.75mg/mL Anti
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Digoxin单克隆抗体用于检测靶标PEDV；T2测试线2包被0.60mg/mL Anti
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ROX单克隆抗体用于检测靶标PoRV；T3测试线3包被0.50mg/mLAnti
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Cy5单克隆抗体用于检测靶标PBoV；C质控线包被2mg/mL羊抗鼠多克隆抗体。5.检测三种猪病毒性腹泻病原的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求3或4所述的试剂盒。6.根据权利要求5所述的检测三种猪病毒性腹泻病原的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：1)获取样本的cDNA：提取并纯化粪便样本中的总DNA和总RNA，将RNA逆转录成cDNA，将DNA与cDNA保存待用；
2)制备阳性标准质粒；3)利用内引物、外引物与带有荧光标记的环...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明洲，马骉，付贤树，张晓峰，帅江冰，俞晓平，叶子弘，孙凯，
申请(专利权)人：浙江省检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：