一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体指涉及一种具有抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞凋亡的鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽及其应用。本发明专利技术以鲟鱼鱼鳔为原料，通过超声波预处理脱脂、碱性蛋白酶酶解，膜超滤、色谱分离纯化得到具有抗肺癌功效的寡肽Gln

【技术实现步骤摘要】
一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体指涉及一种具有抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞凋亡的鲟鱼鱼鳔寡肽及其应用。

技术介绍

[0002]肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，发病率和死亡率增长最快，对人民群众的健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。研发预防或治疗肺癌的药物或其功能产品至关重要。

技术实现思路

[0003]本申请专利技术人经过反复研究，以鲟鱼鱼鳔为原料，利用酶解工艺和色谱制备技术制备得到具有显著抑制人肺癌细胞增殖和促进人肺癌细胞凋亡的抗肿瘤寡肽，该抗肿瘤寡肽可用于制备预防或治疗肺癌相关的药物和功能产品。
[0004]一方面，本专利技术一种具有显著抑制人肺癌细胞增殖和促进人肺癌细胞凋亡的鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽，该抗肿瘤寡肽为五肽化合物，其氨基酸序列为Gln
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Pro
‑
His
‑
Asp
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Lys(QPHDK)，ESI
‑
MS测定其分子量为623.66Da。
[0005]另一方面，本专利技术提供了上述鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽的制备方法，其包括以下步骤：
[0006]1)鲟鱼鱼鳔的预处理：将鲟鱼鱼鳔解冻，将乙酸乙酯加入到鲟鱼鱼鳔中，组织捣碎机匀浆，然后于40kHz超声脱脂，干燥；
[0007]2)鲟鱼鱼鳔蛋白的酶解：将上述脱脂鲟鱼鱼鳔粉末加入到甘氨酸
‑
NaOH缓冲液中，溶液调温至50～60℃，调节pH值至8.6～10.6，加入碱性蛋白酶，水解4～6h；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至室温，离心，收集上清液，即鲟鱼鱼鳔酶解液。
[0008]3)鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽的制备：将鲟鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为1.0kDa、3.5kDa和5.0kDa的超滤膜进行分级，收集分级组分，测定其抑制人肺癌细胞株(A549)增殖的能力，选择对人肺癌细胞株(A549)增殖抑制能力最强的组分冻干，得鲟鱼鱼鳔超滤酶解物，该超滤酶解物溶液并依次经过凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP
‑
HPLC)纯化，得到具有显著抑制人肺癌细胞增殖和促进人肺癌细胞凋亡活性的鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽。
[0009]作为优选，所述步骤1)中的鲟鱼为西伯利亚鲟(Acipenser baerii)。
[0010]作为优选，所述步骤1)中的鲟鱼鱼鳔与乙酸乙酯的料液比为1g:8～10mL。
[0011]作为优选，所述步骤2)中甘氨酸
‑
NaOH缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为9.6。
[0012]作为优选，所述步骤2)中脱脂鲟鱼鱼鳔粉末与0.05mol/L的甘氨酸
‑
NaOH缓冲液的料液比为1g:12～15mL。
[0013]作为优选，所述步骤2)中碱性蛋白酶的添加量为鲟鱼鱼鳔粉末重量2.0～3.0％。
[0014]作为优选，所述步骤3)的凝胶柱层析和RP
‑
HPLC纯化的具体过程为：
[0015]凝胶柱层析：将上述鲟鱼鱼鳔超滤酶解物溶解于双蒸水配成浓度为30～40mg/mL的溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH
‑
20柱层析分离，用磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，
pH 7.0)进行洗脱，流速0.8～1.2mL/min，根据220nm下的吸光值绘制色谱图，收集各色谱峰，测定各色谱峰组份对人肺癌细胞株(A549)增殖的抑制能力，选择抑制能力最强的色谱峰组分，冻干，得鲟鱼鱼鳔凝胶层析酶解物。
[0016]RP
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HPLC纯化：将上述鲟鱼鱼鳔凝胶层析酶解物用双蒸水配成50～60μg/mL的溶液，利用RP
‑
HPLC进行纯化，根据色谱峰分离制备寡肽组份，然后测定各组份对人肺癌细胞株(A549)增殖的抑制能力，得1个高活性抗肺癌寡肽Gln
‑
Pro
‑
His
‑
Asp
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Lys(QPHDK)，ESI
‑
MS测定分子量为623.66Da。
[0017]作为进一步优选，所述RP
‑
HPLC条件为：进样量10～15μL；色谱柱Zorbax,SB C
‑
18(4.6
×
250mm，5μm)；流动相：梯度洗脱，乙腈浓度在30min内从0匀速提高至60％；洗脱速度1.0～1.5mL/min；紫外检测波长220nm。
[0018]再一方面，本专利技术提供上述鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽在制备预防治疗肺癌的药物中的用途。
[0019]本专利技术鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽Gln
‑
Pro
‑
His
‑
Asp
‑
Lys(QPHDK)可以显著地抑制人肺癌细胞株A549、NCL
‑
H460和H1299的增殖，促进人肺癌细胞株A549、NCL
‑
H460和H1299的凋亡，具有显著的抗肺癌功效；具有安全无毒副作用、活性强等优点，可用于制备预防或治疗肺癌相关的药物或其功能产品。
附图说明
[0020]图1为本专利技术的鲟鱼鱼鳔酶解液(SBH)和超滤组分(SBH
‑
I～SBH
‑
IV)在4.0mg/mL浓度下对人肺癌细胞株(A549)增殖的抑制能力。
[0021]图2为本专利技术的鲟鱼鱼鳔酶解液超滤组分(SBH
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I)经羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH
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20柱层析得到色谱图。
[0022]图3为本专利技术的羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH
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20制备酶解物组份(SBH
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Ia～SBH
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Ic)在2.0mg/mL浓度下对人肺癌细胞株(A549)增殖的抑制能力。
[0023]图4为本专利技术的羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH
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20制备酶解物(SBH
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Ib)经RP
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HPLC分离得到的色谱图。
[0024]图5为本专利技术的RP
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HPLC分离组分(BP1～BP11)在2.0mg/mL浓度下对人肺癌细胞株(A549)增殖的抑制能力。
[0025]图6为本专利技术的抗肺癌寡肽Gln
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Pro
‑
His
‑
Asp
‑
Lys(QPHDK)的质谱图。
[0026]图7为本专利技术的抗肺癌寡肽Gln
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Pro
‑
His
‑
Asp
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Lys(QPHDK)的结构图。
[0027]图8为本专利技术的抗肺癌寡肽QPHDK在0.5
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2.5mg/mL浓度下对人肺癌细胞株A549、NCL
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽，其特征在于，所述抗肿瘤寡肽为五肽化合物，其氨基酸序列为Gln
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Pro
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His
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Asp
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Lys(QPHDK)，ESI
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MS测定其分子量为623.66Da。2.一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)鲟鱼鱼鳔的预处理：将鲟鱼鱼鳔解冻，将乙酸乙酯加入到鲟鱼鱼鳔中，组织捣碎机匀浆，然后于40kHz超声脱脂，干燥；2)鲟鱼鱼鳔蛋白的酶解：将上述脱脂鲟鱼鱼鳔粉末加入到甘氨酸
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NaOH缓冲液中，溶液调温至50～60℃，调节pH值至8.6～10.6，加入碱性蛋白酶，水解4～6h；然后在95℃水浴中保温15min灭酶，冷却至室温，离心，收集上清液，即鲟鱼鱼鳔酶解液。3)鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽的制备：将鲟鱼鱼鳔酶解液经截留分子量为1.0kDa、3.5kDa和5.0kDa的超滤膜进行分级，收集分级组分，测定其抑制人肺癌细胞株(A549)增殖的能力，选择对人肺癌细胞株(A549)增殖抑制能力最强的组分冻干，得鲟鱼鱼鳔超滤酶解物，该超滤酶解物溶液并依次经过凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP
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HPLC)纯化，得到具有显著抑制人肺癌细胞增殖和促进人肺癌细胞凋亡活性的鲟鱼鱼鳔抗肿瘤寡肽。3.如权利要求2所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的鲟鱼为西伯利亚鲟(Acipenser baerii)。4.如权利要求2所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的鲟鱼鱼鳔与乙酸乙酯的料液比为1g:8～10mL。5.如权利要求2所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中甘氨酸
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NaOH缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为9.6。6.如权利要求2所述一种鲟鱼鱼鳔抗肺癌寡肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中脱脂鲟鱼鱼鳔粉末与0.05mol/L的甘氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伶，王斌，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：