一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用。通过采用HNCQDs/H2O2体系和Ru(bpy)

【技术实现步骤摘要】
一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用


[0001]本专利技术涉及一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器用于miRNA
‑
222检测，属于生物传感
，该生物传感器基于双阳极ECL信号强度的变化，通过信号比值，从而实现对血清中miRNA的定量检测分析。

技术介绍

[0002]微小核糖核苷酸（microRNA，miRNA）在细胞的增殖、迁移以及凋亡过程扮演着重要作用，其通常由18 ~ 23个核苷酸组成。近年来，已经有诸多研究表明miRNA能够作为癌症早期诊断的重要标志物。随着研究的不断深入，研究者发现miRNA能够参与调控靶蛋白的表达，诱导癌细胞对抗癌药物产生耐药性。其中miRNA
‑
222表达水平的升高是诸多癌症发生的危险因素，包括甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌等。同时，miRNA
‑
222的异常表达还与肿瘤细胞耐药性产生高度相关。因此，对于miRNA
‑
222的精准检测在癌症早期的临床诊断与指导个体化用药方面具有十分重要的意义。
[0003]电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）技术结合电化学与化学发光的优势，因输入电信号与输出的光信号之间互不干扰且不需要外部激发光源，具有高灵敏度、低背景信号的特点，尤其适合低丰度目标物的检测分析。随着ECL技术的不断发展，通过设计不同ECL体系结合多样化信号放大策略、开发新型高效的发光探针以及纳米材料修饰等手段，用以提高ECL生物传感器的检测性能。基于双信号的比率型ECL生物传感器，以两个ECL强度之间的比值进行自校正，有效规避外部环境干扰，突破了单信号分析方法的局限性，在低丰度且易受RNA酶降解的miRNA检测方面更具优势。但在构建比率型ECL生物传感器时，这两种ECL体系存在于同一个反应环境中，选取适宜的ECL体系至关重要，需考虑ECL发光探针及共反应剂之间的交叉反应、激发电位的调控以及ECL光谱的区分等因素，在一定程度上限制了ECL体系的选择范围，极大阻碍了比率型ECL生物传感器的发展及应用。
[0004]双极电极（Bipolar electrode，BPE）因无需直接接触电压并易于控制，作为一种新型的“无线技术”在分析领域中占据一席之地。其中，闭合式BPE能够在空间上有效隔绝两个电解池溶液间交换，避免复杂的分析环境；同时，基于电中性原理，整个闭合式BPE遵循电子守恒定律，因此两电解池发生的氧化还原反应是相互关联，这为构建比率型ECL生物传感器提供了得天独厚的优势。目前，开发的比率型双极电极电化学发光（BPE
‑
ECL）生物传感器在生物分析领域中已有一定的报道，然而，其中的阴极ECL体系往往需要较高的驱动电压产生信号，容易损毁导电材料的界面并产生副反应，这不利于信号稳定输出与目标物的准确定量。因此，选用低激发电位的ECL发光探针用于构建比率型BPE
‑
ECL生物传感器，将有利于开发高灵敏且稳定性好的即时检测设备。
[0005]碳量子点（Carbon quantum dots，CQDs）因其具有尺寸可调、易于表面修饰、制备成本低以及好的生物相容性等优点，已经成为一种新兴的ECL碳基纳米材料。然而，碳量子点在BPE
‑
ECL传感器中的应用鲜有报道，主要是受限于两个因素：（1）CQDs在电化学反应中
生成激发态需要强氧化性的共反应物参与，激发电位较高，由于BPE分压作用，导致驱动电压过高难以实现有效驱动；（2）CQDs与共反应物之间作用较弱，导致发光效率较低，ECL信号较弱，限制了高灵敏度检测方法的构建。这些问题仍亟待解决。
[0006]本专利技术公开一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器用于miRNA
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222检测。以柠檬酸为碳源，水合肼作为改性剂，选取N, N
‑
二甲基甲酰胺为溶剂通过微波辐射法快速、高效地制备一种具有酰肼类结构的氮掺杂碳量子点（HNCQDs）作为ECL发光探针。采用选用Ru(bpy)
32+
/TPrA体系和HNCQDs/H2O2体系为双阳极ECL信号源，构建基于新型比率型BPE
‑
ECL生物传感器检测miRNA
‑
222。金纳米粒子修饰BPE阴极区域，通过Au
‑
S键固相化捕获探针（Capture probe DNA）。当存在miRNA
‑
222时，捕获探针能够识别miRNA
‑
222以及ALP
‑
Au NPs标记的辅助探针，三者通过碱基互补配对形成Y型核酸杂交构型。修饰的ALP催化前体p
‑
APP的磷酸酯键水解断裂，生成的p
‑
AP在驱动电极阳极易发生氧化反应，加速电子传递速率，使BPE芯片中总电流增大，导致HNCQDs/H2O2体系信号（ECL
HNCQDs
）增大。同时，p
‑
AP以及氧化产物p
‑
QI对Ru(bpy)
32+
/TPrA体系信号（ECL
Ru
）有猝灭作用，导致ECL
Ru
信号减小。通过ECL
HNCQDs
与ECL
Ru
的强度比值，实现对miRNA
‑
222进行定量分析。构建的比率型BPE
‑
ECL生物传感器可在低电压驱动下，可以实现对miRNA
‑
222的高灵敏检测，并表现出出色的特异性与信号稳定性，在临床疾病早期诊断中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0007]1. 本专利技术的目的是提供一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器用于miRNA
‑
222的检测。
[0008]2. 本专利技术所述的一种低电压驱动比率型BPE
‑
ECL生物传感器，采用选用Ru(bpy)
32+
/TPrA体系和HNCQDs/H2O2体系为双阳极ECL信号源，再结合“Y”型核酸杂交结构并采用ALP
‑
Au NPs标记的辅助探针作为酶催化信号放大策略中的信号探针，构建了能在低电压驱动下工作的比率型BPE
‑
ECL生物传感器，实现对miRNA
‑
222的定量分析。
[0009]3. 本专利技术的一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器的制备方法，依序包括如下步骤：（1）HNCQDs的合成将2.1 g柠檬酸溶于15 mL的DMF中，然后将1.25 mL水合肼逐滴加入形成胶状的混合前体。将胶状前体置于微波反应装置（800 W）中，反应300 s。得大块多孔固体，加入15 mL水溶解反应产物，离心（10,000 rpm，10 min），除去大块黑色沉淀物。静置沉淀，取上清液，经0.45 μm和0.22 μm过滤，并用截留分子量（Molecular本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的生物传感器包括双阳极ECL发光探针以及共反应剂、基于ITO和PDMS构建的双极电极芯片、阴极池中所包含的用于检测miRNA
‑
222的核酸探针和试剂，所述的生物传感器能用于miRNA
‑
222的特异灵敏检测。2.根据权利要求1所述的一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的双阳极ECL发光探针以及共反应剂为HNCQDs/H2O2体系和Ru(bpy)
32+
/TPrA体系。3.根据权利要求2所述的一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述HNCQDs/H2O2体系中HNCQDs的合成：1 ~ 5 g柠檬酸溶于5 ~ 15 mL的DMF中，然后将0.5 ~ 2.5 mL水合肼逐滴加入形成胶状的混合前体，置于功率为800 W的微波反应装置中，反应100 ~ 500 s；得大块多孔固体，加水溶解反应产物，静置沉淀，取上清液，透析24 h后，60 ℃干燥，得HNCQDs；所述Ru(bpy)
32+
/TPrA体系中的Ru(bpy)
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浓度为0.25 mM ~ 1 mM，TPrA浓度为 2.5 mM ~ 10 mM；所述HNCQDs/H2O2体系中的HNCQDs浓度为0.1 mg/mL ~ 1.25 mg/mL，H2O2浓度为 50 mM ~ 800 mM。4.根据权利要求1所述的一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的双极电极驱动电压为0 ~ 3.5 V。5.根据权利要求1所述的一种低电压驱动比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，用于检测miRNA
‑
222的核酸探针为捕获探针和ALP
‑
Au NPs标记的辅助探针，其制备步骤包括：（1）捕获探针（Capture probe DNA），序列：5'
‑ꢀ
SH
‑
(CH2)6‑
GGCTGTTTTTTGAGACCCACGATAGATTTTTTTCAGCC
‑
(CH2)6‑
SH
ꢀ‑
3'；（2）辅助探针（Assistant probe DNA），序列：5'
‑
TCTATCGGTAGCCAGATGTAGCT
‑
(CH2)6‑
SH
‑
3'；（3）ALP
‑
Au NPs标记的辅助探针，其修饰过程如下：85 mL沸腾的水中加入10 mL 浓度为1.2 mM 的HAuCl4溶液，加热沸腾后，加入5 mL浓度为38.7 mM的柠檬酸钠溶液，保持反应体系处于微沸状态30 min，得Au NPs溶液；将80
ꢀµ
L 浓度为0.8 mg/mL ALP稀释液和40
ꢀµ
L 浓度为1
ꢀµ
M Assistant probe DNA加入4 mL pH = 8.2的Au NPs溶液中反应2 h；加入8...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷云，刘爱林，张子阳，张宇，韩舒桦，程章健，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：