重组人源透皮弹性蛋白及其表达菌株制造技术

本发明专利技术公开了一种重组人源透皮弹性蛋白及其表达菌株。所述的重组人源透皮弹性蛋白序列为由SPACE透皮肽用连接肽融合到1

【技术实现步骤摘要】
重组人源透皮弹性蛋白及其表达菌株


[0001]本专利技术属于基因工程领域，涉及一种重组人源透皮弹性蛋白及其表达菌株。

技术介绍

[0002]弹性蛋白是一类构成细胞外基质的结构蛋白，由成纤维细胞和角质形成细胞合成分泌，与微原纤维结合后形成弹性纤维，弹性纤维与胶原纤维共同存在，赋予所在组织和器官以伸缩性和可逆的变形能力。虽然弹性蛋白仅占皮肤总蛋白含量的2
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4％，但它对皮肤结构的维持至关重要。弹性蛋白通常以疏水和亲水性的短肽段交替排列构成，富含甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸等非极性氨基酸(疏水氨基酸)，含量高达95％，由36个外显子编码，其中24号外显子是弹性蛋白典型的疏水功能域。弹性蛋白初合成时为水溶性单体，分子量为60
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70kDa，称为原弹性蛋白。在成纤维细胞中，原弹性蛋白单体结合形成复合物，然后被释放到细胞外基质中，2
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4个原弹性蛋白通过四个赖氨酸残基在赖氨酸氧化酶催化下环化形成的锁链素/异锁链素组装到一起，形成一种非晶态、不溶和稳定的聚合物结构，即弹性蛋白。
[0003]弹性蛋白在组织工程中应用范围较广，如软骨和椎间盘组织工程、眼组织工程、肝组织工程等。然而天然提取弹性蛋白往往面临人畜共患病风险，来源供给不足，纯化工艺复杂和最终得率低等问题。此外，皮肤角质层作为人体的天然屏障，往往限制了大分子物质经皮进入到真皮层，由于天然提取弹性蛋白因分子量较大，因此其难以穿越表皮屏障进入浅表真皮组织发挥其生物学作用。利用基因工程技术，人工设计合成与天然弹性蛋白氨基酸序列具有相似特性的类弹性蛋白，有望解决天然提取弹性蛋白存在的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种重组人源透皮弹性蛋白及其表达菌株。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]本专利技术所述的重组人源透皮弹性蛋白为由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的氨基端、羧基端或者两端所形成的融合蛋白。
[0007]具体地，本专利技术所述的重组人源透皮弹性蛋白为6种融合蛋白，分别为由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的氨基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E1.1，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的羧基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E1.2，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到氨基酸序列如
SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的氨基端和羧基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E1.3，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到2个拷贝的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的氨基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E2.1，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到2个拷贝的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的羧基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E2.2，其氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到2个拷贝的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的氨基端和羧基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E2.3，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
[0008]本专利技术根据毕赤酵母的密码子偏好性，对重组人源透皮弹性蛋白进行密码子优化，得到的重组人源透皮弹性蛋白E1.1的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，重组人源透皮弹性蛋白E1.2的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，重组人源透皮弹性蛋白E1.3的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，重组人源透皮弹性蛋白E2.1的核苷酸序列如SEQ IDNo.13所示，重组人源透皮弹性蛋白E2.2的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，重组人源透皮弹性蛋白E2.3的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。
[0009]进一步地，本专利技术构建表达重组人源透皮弹性蛋白的菌株，为利用高保真DNA聚合酶PCR扩增重组人源透皮弹性蛋白E1.1、E1.2、E1.3、E2.1、E2.2或E2.3的核苷酸序列，SnaBI和NotI酶切后连接到经相同双酶切的pPIC9K空载体中，菌落PCR和测序验证正确后富集重组质粒并酶切线性化，电转化到毕赤酵母中，通过G418抗性梯度筛选获得的表达重组人源透皮弹性蛋白E1.1、E1.2、E1.3、E2.1、E2.2或E2.3的毕赤酵母基因工程菌SE1.1、SE1.2、SE1.3、SE2.1、SE2.2或SE2.3。
[0010]更进一步地，本专利技术提供上述重组人源透皮弹性蛋白的表达方法，具体为：将表达重组人源透皮弹性蛋白E1.1、E1.2、E1.3、E2.1、E2.2或E2.3的毕赤酵母基因工程菌SE1.1、SE1.2、SE1.3、SE2.1、SE2.2或SE2.3接种在BMMY培养基中，30℃下经甲醇诱导表达72～120小时，收集上清，纯化得到重组人源透皮弹性蛋白E1.1、E1.2、E1.3、E2.1、E2.2或E2.3。
[0011]本专利技术以人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域为基础，将透皮肽SPACE分别融合到1
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2个拷贝的弹性蛋白疏水功能域的氨基端、羧基端或两端，形成的融合蛋白保持了透皮肽SPACE的转导功能，能够携带重组人源弹性蛋白进入真皮层。本专利技术的重组人源透皮弹性蛋白具有优异的促进细胞增殖、迁移以及透皮性能，且能够在毕赤酵母基因工程菌株中稳定、高效表达，在组织工程、医疗器械、美容护肤等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
[0012]图1为重组人源透皮弹性蛋白的质粒pPIC9K
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E1.1示意图。
[0013]图2为重组人源透皮弹性蛋白的质粒pPIC9K
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E1.2示意图。
[0014]图3为重组人源透皮弹性蛋白的质粒pPIC9K
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E1.3示意图。
[0015]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 重组人源透皮弹性蛋白，其特征在于，为由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的氨基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E1.1，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的羧基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E1.2，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的氨基端和羧基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E1.3，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到2个拷贝的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的氨基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E2.1，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到2个拷贝的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的人源弹性蛋白中24号外显子编码的疏水功能域的羧基端所形成的重组人源透皮弹性蛋白E2.2，其氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SPACE透皮肽用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的连接肽融合到2个拷贝的氨基酸序列如SEQ ID No.3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立国，王巍，张旭，
申请(专利权)人：哈尔滨敷尔佳科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：