Wnt重组蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种重组蛋白及其应用，该重组蛋白包括：RRP片段，以及FZD片段或DKK1c片段。本发明专利技术所制备的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，促进细胞的增殖，或抑制细胞的过度增殖及干细胞耗竭，能有效调节Wnt信号通路。路。

【技术实现步骤摘要】
Wnt重组蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体地，涉及Wnt重组蛋白及其应用，更具体地，涉及重组蛋白，核酸分子，表达载体，重组细胞，组合物，所述重组蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物在制备药物或试剂、培养组织、培养类器官中的用途，药物，试剂，培养类器官、组织的方法。

技术介绍

[0002]Wnt(“无翅相关整合位点”或“无翅和Int
‑
1”或“无翅
‑
Int”)配体和其信号在控制许多基本器官和组织(包含骨、肝、皮肤、胃、肠、肾、中枢神经系统、乳腺、味蕾、卵巢、耳蜗和许多其它组织)的发育、内稳态和再生中发挥了关键作用(例如，由Clevers、Loh和Nusse综述，2014；346:1248012)。对Wnt信号传导通路的调节具有治疗变性疾病和组织损伤的潜力。
[0003]Wnt信号是由七种跨膜结构域的卷曲蛋白(Fzd)家族转导。Wnt配体结合Fzd，活化细胞质蛋白Dishevelled和磷酸化Lrp5/6。由此产生信号，该信号抑制β
‑
连环蛋白的磷酸化和降解，继而使得β
‑
连环蛋白稳定。这种稳定是通过Dvl与轴蛋白(使得多种蛋白质在一起的支架蛋白(包括GSK3、APC、CK1和β
‑
连环蛋白))关联，以形成β
‑
连环蛋白降解复合物而引起。稳定的β
‑
连环蛋白随后进入细胞核，与TCF结合并使其转变为一个转录激活蛋白，进而转录激活下游的靶基因。
[0004]将调节Wnt信号通路作为治疗的挑战之一是存在多种Wnt配体和Wnt受体、卷曲蛋白1
‑
10(Fzd1
‑
10)，其中许多组织表达多种Fzd和重叠的Fzd。典型的Wnt信号还涉及作为共受体的低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(Lrp5)或低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白6(Lrp6)，除了Fzd之外，所述共受体也在各种组织中广泛表达。因此，在本领域中显然需要能与一种或多种Fzd和Lrp受体特异性结合的激动剂来调节Wnt信号传导。因此，研究Wnt信号通路激动剂可以为激活Wnt信号通路来作为治疗疾病提供研究模型。
[0005]目前市面上已有的作用于Wnt信号通路抑制剂有β
‑
Catenin/Tcf Inhibitor(FH535)、XAV 939、IWP
‑
2、IQ
‑
1、Dickkopf
‑
1(DKK1)等。其中DKK1是一种分泌蛋白，其与Lrp5/6及另一穿膜蛋白Kremen1/2结合，形成三聚体，诱导快速的细胞内吞，减少细胞膜上的Lrp5/6，由此阻断了Wnt信号向胞内的传递。目前从受体层面抑制Wnt信号通路的抑制剂尤其是Dkk1的效率不高，并不能完全抑制Wnt信号通路。因此，从受体层面研究Wnt信号通路抑制剂可以为高效抑制Wnt信号通路提供方法，可以降低由Wnt信号过高而引起的过度的细胞增殖和干细胞的耗竭，也能为治疗疾病提供研究模型。
[0006]本专利发现的新型Wnt激动剂和抑制剂能有效激活或抑制Wnt信号通路。

技术实现思路

[0007]本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
[0008]经典Wnt信号通路的配体Wnt3a在体内合成过程中，经过棕榈酰转移酶Porcupine棕榈酸修饰后具有疏水性，随后再被运输到细胞膜表面激活Wnt信号通路，棕榈酸修饰在体
外人工合成Wnt3a的过程中具有较大技术难度，使得Wnt3a生长因子价格昂贵。此外，从受体层面抑制Wnt信号通路的抑制剂，尤其是Dkk1不能有效的抑制Wnt信号通路。因此，专利技术人设计了多种针对经典wnt信号通路的重组蛋白，经过大量实验筛选后，意外地获得了优势重组蛋白，所述重组蛋白可以有效激活或抑制wnt信号通路，可以作为wnt信号通路的激活剂或抑制剂，可以治疗或预防Wnt信号通路的相关疾病，并用于制作激活或抑制wnt信号通路的研究模型。
[0009]因此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种重组蛋白。根据本专利技术的实施例，包括RRP片段，以及FZD片段或DKK1c片段。Wnt信号通路可以调节基因的转录，在生物体分化过程中起到重要作用，直接控制者动物体早期发育的增殖、分化等细胞命运；同时，Wnt信号通路激活促进细胞增殖以及存活而不进入分化，因此经典Wnt信号通路也参与肿瘤的形成，过度激活的Wnt信号通路造成细胞异常增殖，从而促进肿瘤的发展；永久性失活APC复合物，即“遗传调控门控基因”缺失，异常激活Wnt信号通路也能促进肿瘤的发展，却并不依赖Wnt配体与受体的结合。因此本专利技术提出的重组蛋白可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病，如非依赖APC突变的结肠癌、乳腺癌、小肠早期恶性前病变、肺癌等。专利技术人通过大量实验对多种蛋白进行截断、组合和筛选，获得了多种优势重组蛋白，根据本专利技术实施例的所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。其中，RRP片段和FZD片段重组获得的重组蛋白包括与一种或多种卷曲蛋白(FZD)受体结合的结合域，可以有效激活Wnt信号通路，且其激活能力为FZD蛋白的几十倍，激活效果显著；RRP片段与DKK1c片段重组获得的重组蛋白具有与低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)和/或低密度脂蛋白受体相关蛋白6(Lrp6)结合的结合域，能有效抑制Wnt信号通路，且其抑制能力为Dkk1和Dkk1c蛋白的几十倍，抑制效果显著。
[0010]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种核酸。根据本专利技术的实施例，所述核酸编码第一方面所述的重组蛋白。根据本专利技术实施例的核酸编码的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。
[0011]在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种表达载体。根据本专利技术的实施例，所述表达载体包括：第二方面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列，这些控制序列可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。本专利技术实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组蛋白，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。
[0012]在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种制备第一方面所述的重组蛋白的方法。根据本专利技术的实施例，包括：将第三方面所述的表达载体导入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组蛋白。根据本专利技术实施例的方法可以大量表达获得重组蛋白，所获得的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其特征在于，包括RRP片段，以及FZD片段或DKK1c片段。2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述RRP片段具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；任选地，所述FZD片段具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；任选地，所述DKK1c片段具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的重组蛋白，其特征在于，进一步包括连接肽；任选地，所述连接肽包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于，所述连接肽的N端与所述RRP片段的C端相连，所述连接肽的C端与所述FZD片段或DKK1c片段的N端相连。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白具有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列具有至少95％、90％、85％同一性的氨基酸序列。6.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1
‑
5任一项所述的重组蛋白。7.根据权利要求6所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO：18或24所示的核苷酸序列。8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求6或7所述的核酸。9.一种制备权利要求1
‑
5任一项所述的重组蛋白的方法，其特征在于，包括：将权利要求8所述的表达载体导入到受体细胞中；将携带有所述表达载体的受体细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组蛋白。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述受体细胞包括真核细胞；任选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞，任选地，所述哺乳动物细胞包括选自小肠细胞、T细胞、CHO
‑
K1、CHOS、293F、293T、CAR
‑
T、TCR
‑
T、TIL、CAR
‑
NK、CAR
‑
M和CAR
‑
DC中的至少之一。11.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体或表达权利要求1
‑
5任一项所述的重组蛋白。12.一种组合物，其特征在于，包括：权利要求1
‑
5任一项所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体或权利要求11所述的重组细胞。13.权利要求1
‑
5任一项所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞或权利要求12所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。14.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵冰，代权辉，倪超，
申请(专利权)人：伯桢生物科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：