用于推断男女混合血斑中男性年龄的位点组合、扩增引物、测序引物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了用于推断男女混合血斑中男性年龄的位点组合、扩增引物、测序引物、试剂盒和方法，通过筛选多个Y

【技术实现步骤摘要】
用于推断男女混合血斑中男性年龄的位点组合、扩增引物、测序引物、试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及用于推断男女混合血斑中男性年龄的位点组合、扩增引物、测序引物、试剂盒和方法。属于法医学年龄推断


技术介绍

[0002]随着衰老相关研究的开展，年龄推断已成为法医学研究点。年龄推断可缩小侦查范围，为案件侦破提供指向性线索，辅助灾难事故受害人身份认定。目前法医临床学主要通过个体的骨性特征进行年龄推断，例如长骨骨骺闭合状态、牙齿、盆骨X线影像特征等。但是影像学特征并不适用于犯罪现场遗留的生物检材(如血斑、精斑、毛发等)检测。
[0003]为解决此类难题，法医学家提出用分子生物学标记进行年龄推断。近年来，随着甲基化微阵列芯片和全基因组甲基化技术的开展，已有多项研究表明某些DNA甲基化水平与年龄存在线性相关，具有“表观遗传学时钟”之称，在年龄推断方面明显优于其他分子标记物：端粒长度消减、天冬氨酸的外消旋化等。2011年，Bocklandt等人首次开发了基于88个常染色体CpG位点的表观遗传学年龄预测，其对唾液组织的年龄估计偏差为5.2岁。同年，Koch等人筛选了5个常染色体CpG位点用于表观遗传衰老特征研究，并被法医学用于年龄推断。随后临床学者和法医学者开展了针对不同样本类型、不同人群的全因死亡风险评估以及年龄预测研究。
[0004]目前主要通过常染色体CpG位点进行年龄估计，但最近的研究发现年龄具有性别差异，如女性更有长寿优势，男性在衰老相关性疾病中的发病率更高。且常染色体CpG位点并不适用于法医现场男女混合血斑年龄推断。已有研究提出运用Y
‑
CpG进行男性年龄推断或男性致死性疾病研究。但Y染色体存在大量的回文结构，且Y
‑
CpG位点数量较少，导致年龄预测精度偏低。
[0005]因此，提供一种相对精准推断男性年龄的方法已成为法医学亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供用于推断男女混合血斑中男性年龄的位点组合、扩增引物、测序引物、试剂盒和方法，基于Y染色体甲基化和单倍群共检测，实现男性年龄推断。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0008]1、用于推断男女混合血斑中男性年龄的位点组合，所述位点组合包含：
[0009](A
‑
A
’
)2个Y
‑
CpG：
[0010]位点cg19272606，位置chrY:21871534；
[0011]位点cg09730640，位置chrY:14533708；
[0012]4个Y
‑
SNP：
[0013]位点M231，单倍群N，位置chrY:15469724；
[0014]位点F265，单倍群O1，位置chrY:14727776；
[0015]位点M122，单倍群O2，位置chrY:21764674；
[0016]位点M207，单倍群R，位置chrY:15581983；
[0017](B
‑
B
’
)4个Y
‑
CpG：
[0018]位点cg04691144，基因NLGN4Y，位置chrY:16634373；
[0019]位点cg14248084，位置chrY:14076009；
[0020]位点cg27443332，基因NLGN4Y，位置chrY:16634795；
[0021]位点cg26198148，基因TMSB4Y，位置chrY:15814685；
[0022]1个Y
‑
SNP：
[0023]位点M130C，单倍群C，位置chrY:2734854。
[0024]作为优选的技术方案之一，所述位点组合还包含：
[0025]1个荧光染料质控位点FI
‑
QC(fluorescence intensity quality control)，基因rs35962976，位置chr2:123845383；FI
‑
QC位点为常染色体C/T突变位点；
[0026]1个重亚硫酸盐转化质控位点BC
‑
QC(bisulfite conversion quality control site)，位置chrY:14075944。BC
‑
QC位点位于cg14248084上游，两者可共用一对PCR引物。
[0027]位点信息表见表1。
[0028]表1.位点信息表
[0029][0030][0031]2、基于前述位点组合的用于推断男女混合血斑中男性年龄的扩增引物，包含复合扩增引物混合物A和复合扩增引物混合物B，所述的复合扩增引物混合物A包含如SEQ ID NO.9～12所示的2个Y
‑
CpG和如SEQ ID NO.1～8所示的4个Y
‑
SNP的12条扩增引物；所述的复合扩增引物混合物B包含如SEQ ID NO.15～22所示的4个Y
‑
CpG和如SEQ ID NO.13～14所示的1个Y
‑
SNP的10条扩增引物。
[0032]作为优选的技术方案之一，所述的复合扩增引物混合物B还包含如SEQ ID NO.17～18所示的质控位点BC
‑
QC的2条扩增引物。BC
‑
QC位点与cg14248084共用一对扩增引物，因此减少引物间二聚体和发卡结构发生，保证扩增效率。
[0033]扩增引物的核苷酸序列见表2。
[0034]表2.扩增引物核苷酸序列
[0035][0036]3、用于推断男女混合血斑中男性年龄的测序引物，包含复合测序引物混合物A
’
和复合测序引物混合物B
’
，其中，所述的复合测序引物混合物A
’
包含如SEQ ID NO.27～28所示的2个Y
‑
CpG、如SEQ ID NO.23～26所示的4个Y
‑
SNP的6条测序引物；所述的复合测序引物混合物B
’
包含如SEQ ID NO.32～35所示的4个Y
‑
CpG、如SEQ ID NO.31所示的1个Y
‑
SNP的5条测序引物。
[0037]作为优选的技术方案之一，所述的复合测序引物混合物A
’
还包含如SEQ ID NO.29～30所示的质控位点FI
‑
QC的2条测序引物；所述的复合测序引物混合物B
’
还包含如SEQ ID NO.36所示的1个质控位点BC
‑
QC、如SEQ ID NO.29～30所示的1个质控位点FI
‑
QC的3条测序引物。
[0038]测序引物的核苷酸序列见表3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于推断男女混合血斑中男性年龄的位点组合，其特征在于，所述位点组合包含：(A
‑
A
’
)2个Y
‑
CpG：位点cg19272606，位置chrY:21871534；位点cg09730640，位置chrY:14533708；4个Y
‑
SNP：位点M231，单倍群N，位置chrY:15469724；位点F265，单倍群O1，位置chrY:14727776；位点M122，单倍群O2，位置chrY:21764674；位点M207，单倍群R，位置chrY:15581983；(B
‑
B
’
)4个Y
‑
CpG：位点cg04691144，基因NLGN4Y，位置chrY:16634373；位点cg14248084，位置chrY:14076009；位点cg27443332，基因NLGN4Y，位置chrY:16634795；位点cg26198148，基因TMSB4Y，位置chrY:15814685；1个Y
‑
SNP：位点M130，单倍群C，位置chrY:2734854。2.根据权利要求1所述的位点组合，其特征在于，所述位点组合还包含：1个荧光染料质控位点FI
‑
QC，基因rs35962976，位置chr2:123845383；FI
‑
QC位点为常染色体C/T突变位点；1个重亚硫酸盐转化质控位点BC
‑
QC，位置chrY:14075944。BC
‑
QC位点位于cg14248084上游，两者可共用一对PCR引物。3.基于权利要求1或2所述位点组合的用于推断男女混合血斑中男性年龄的扩增引物，其特征在于，包含复合扩增引物混合物A和复合扩增引物混合物B，所述的复合扩增引物混合物A包含如SEQ ID NO.9～12所示的2个Y
‑
CpG和如SEQ ID NO.1～8所示的4个Y
‑
SNP的12条扩增引物；所述的复合扩增引物混合物B包含如SEQ ID NO.15～22所示的4个Y
‑
CpG和如SEQ ID NO.13～14所示的1个Y
‑
SNP的10条扩增引物。4.根据权利要求3所述的扩增引物，其特征在于，所述的复合扩增引物混合物B还包含如SEQ ID NO.17～18所示的质控位点BC
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：谢明坤，李介男，张卫社，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：