一种制备表雄酮的方法技术

本申请提供了一种制备表雄酮的方法，包括如下步骤：用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α

【技术实现步骤摘要】
一种制备表雄酮的方法


[0001]本专利技术涉及生物领域，更具体地，涉及制备表雄酮的方法。

技术介绍

[0002]表雄酮(Epiandrosterone)结构式如下所示，是人体分泌的甾体化合物，同时，也是合成甾体激素药物的前体。
[0003][0004]目前已经公开的制备表雄酮的方法中，均为化学法。例如，有报道，4
‑
雄烯二酮经醚化保护反应、钯炭催化加氢还原反应、酸催化水解脱保护反应三步反应合成表雄酮，这种方法存在反应路线长，收率低且环境问题严重等问题。此外，并未有生物法制备表雄酮的报道。
[0005]在4
‑
AD生成5α
‑
AD中间体的生物转化的发酵法(如下反应式所示)的报道中，存在产率低，产物不纯，存在分离提取等问题，同样存在实用性问题。因此，期待进一步的改进。
[0006]
技术实现思路

[0007]本申请提供了一种简单易行的合成表雄酮的生物方法。该方法操作简单，条件温和，对环境友好，并且能够大幅度降低生产的成本，适合大规模工业化生产。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]步骤1)，用分枝杆菌细胞膜固定化5α
‑
还原酶，用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α
‑
还原酶的过表达载体，电转化至分枝杆菌中，在30℃下表达，并收集带有5α
‑
还原酶的细胞或膜碎片。
[0010]往步骤1)中加入4/>‑
雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80等，在温度30℃下反应30
‑
60h，控制整个反应过程的pH值在6.5～8.5，TLC检测反应进程，当转化率达90
‑
99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中固定化细胞或膜碎片和底物投料质量比为2～0.5：1。
[0011]优选地，所述的5α
‑
还原酶的基因序列经分枝杆菌密码子优化的序列。
[0012]优选地，所述的5α
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还原酶的基因序列与序列11
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21中的任一序列具有至少80％以上的同源性。
[0013]优选地，所述的5α
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还原酶的N端接入信号肽。
[0014]优选地，所述的信号肽基因为微生物自身所特有的。
[0015]进一步优选地，所述的带有信号肽的5α
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还原酶是在非致病微生物中的表达产物。
[0016]更进一步优选地，所述的非致病微生物为分枝杆菌。
[0017]优选地，步骤1)中所述的固定化为5α
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还原酶需处于脂膜环境。
[0018]优选地，步骤1)中所述的脂膜选择细胞膜。
[0019]优选地，分枝杆菌包括分枝杆菌3805、分枝杆菌3863、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌、新金分枝杆菌等。
[0020]更优选地，所述分枝杆菌为新金分支杆菌。
[0021]更优选地，所述分枝杆菌具体为新金分枝杆菌B
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3805，本专利技术将其命名为ABI10菌种。
[0022]进一步优选地，所述新金分枝杆菌B
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3805，可从Leibniz Institute DSMZ
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German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH购买，货号为：DSM 2967，B
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3805为快速生长、非致病性微生物。
[0023]优选地，步骤2)中所述的水相缓冲液为pH为7.5的0.01M磷酸盐缓冲液，该缓冲液由8g/L NaCl，0.27g/L KH2PO4，0.2g/L KCl，1.14g/L Na2HPO4组成。
[0024]优选地，步骤2)中所述的吐温80的浓度为0.01
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1％。
[0025]更优选地，步骤2)中所述的吐温80的浓度为0.05％。
[0026]优选地，步骤2)中所述的羟丙基
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β
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环糊精与4
‑
AD的质量比为0.1：1。
[0027]优选地，所述的4
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雄烯二酮底物浓度为50
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100g/L。
[0028]更优选地，固定化5α
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还原酶与4
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AD投料质量比为2
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0.5：1。
[0029]优选地，具体实施过程如下：
[0030]步骤1)，用分枝杆菌细胞膜固定化5α
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还原酶，用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α
‑
还原酶的过表达载体，电转化至分枝杆菌中，在30℃下表达，并收集带有5α
‑
还原酶的细胞或膜碎片。
[0031]往步骤1)中加入4
‑
雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80等，在温度30℃下反应30
‑
60h，控制整个反应过程的pH值在6.5～8.5，TLC检测反应进程，当转化率达90
‑
99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中固定化细胞或膜碎片和底物投料质量比为2～0.5：1。
[0032]在一个实施方式中，所述信号肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者与序列SEQ ID NO.3
‑
10中的任一序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列。
[0033]优选地，所述脂蛋白LPQH的信号肽基因来源于放线菌和假单胞菌，优选地，所述放线菌包括红球菌、诺卡氏菌、分枝杆菌、链霉菌和节杆菌。更佳地，所述脂蛋白LPQH的信号肽基因来源于分枝杆菌。
[0034]本专利技术与现有技术相比具有下列优点：本专利技术的一种制备表雄酮的方法，与现有路线相比，通过一步生物法，采用更温和的反应条件，使得本专利技术的制备方法实现了产物收率高、纯度高的目的，同时解决了辅酶再生的技术难题，具有较高的实用价值。
附图说明
[0035]图1为基因工程菌ABI10
p261
‑
lpqh
‑
5α
‑
Re
重组菌PCR验证图，M：DL2000DNA Marker；1
‑
10：不同菌落PCR扩增条带，其中3和8号显示正确条带。
[0036]图2为纯化产物的异核单量子相干谱(HSQC)图。
[0037]图3为纯化产物的二维NOE谱(NOESY)图。
具体实施方式
[0038]下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。
[0039]实施例一、1.1带有信号肽的5α
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还原酶基因过表达载体的构建
[0040]首先，结合NCBI序列查找及比对分析，发现分枝杆菌中细胞膜表面有许多本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备表雄酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：用分枝杆菌自身的脂蛋白上的信号肽序列，构建带有信号肽的5α
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还原酶过表达载体，转化至分枝杆菌中进行表达，并收集带有5α
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还原酶的细胞或细胞碎片；往带有5α
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还原酶的细胞或细胞碎片中加入4
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雄烯二酮、水相缓冲液、吐温80、羟丙基
‑
β
‑
环糊精，反应30
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60h，控制整个反应过程的pH值在6.5～8.5，利用薄层色谱法检测反应进程，当转化率达90
‑
99％时，反应结束，得到产物表雄酮，其中带有5α
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还原酶的细胞或细胞碎片和4
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雄烯二酮的质量比为2～0.5：1。2.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述分枝杆菌为KstD基因和Ksh基因已失活的基因工程菌。3.根据权利要求1所述的制备表雄酮的方法，其特征在于，所述水相缓冲液为pH...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏正定，宋士奎，成细瑶，张海艳，周曦，
申请(专利权)人：武汉艾默佳华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：