本发明专利技术公开了一种肺癌DNA甲基化位点检测的引物组合物及其应用，属于生物技术检测技术领域。该发明专利技术公开了两个与肺癌相关的特异性甲基化标志物及引物组合物，采用基于荧光探针PCR的方法，通过检测血浆中肺癌相关ALX3基因和HOXC13基因ctDNA甲基化水平，可以有效判断早期肺癌发生情况。本发明专利技术通过检测两个与肺癌相关的特异性甲基化标志物，灵敏度高，特异性好，能够显著提高肺癌的检出率，相较NGS检测，大幅减低检测成本。并鉴于血浆检测的无创性，适于大规模推广应用。适于大规模推广应用。适于大规模推广应用。
【技术实现步骤摘要】
一种肺癌DNA甲基化位点检测的引物组合物及其应用
[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于肺癌DNA甲基化位点检测的引物组合物及应用。
技术介绍
[0002][0003]肺结节是肺内占位性病变。根据其直径大小来定义，肺内直径≤3cm的类圆形或不规则形病灶，可单发或者多发，称之为肺结节。肺结节直径在0.5cm
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1cm属于肺小结节，直径＞3cm则称为肿块。根据CT影像学表现，肺结节可以分为纯磨玻璃结节、混合磨玻璃结节和实性结节。纯磨玻璃结节就像磨砂玻璃一样，呈现出云絮状的阴影；实性结节则是肺内密度比较高的阴影；混合磨玻璃结节，既包含实性成分，也包含磨玻璃成分，通常实性成分在磨玻璃成分中间。胸膜凹陷征、引流线征、血管集束征、毛刺征、棘突征、分叶征、空泡和细支气管充气征等CT影像改变，都是肺结节恶变的征象。其中，恶变概率的排列顺序应该是：混合磨玻璃结节＞磨玻璃结节＞实性结节。
[0004]国际肺癌研究协会(IASLC)提倡使用液体活检来诊断非小细胞肺癌(NSCLC)。血浆游离肿瘤DNA(ctDNA)甲基化液体活检最大的优势就是可以在超早期通过常规手段无法检测到的情况下检测出是否有细胞癌变的可能。DNA甲基化与肿瘤的发生及紧密相关，在肿瘤细胞普遍着DNA甲基化状态的改变，特点是总体甲基化水平降低和局部甲基化水平的升高。而且对于早期肿瘤的发生，甲基化的修饰也起着至关重要的作用。同时相对于其他血液肿瘤标记物来说，血液ctDNA甲基化稳定性更好，可以被稳定检出。因此，检测特定位点血液ctDNA甲基化，可以用于推测身体内肺癌是否存在癌变，从而实现对肺癌早期诊断的目标。
[0005]目前，肺癌ctDNA甲基化的检测手段多为NGS，该方法耗时长，费用较高，需要专业人员进行生信分析，因此，不利于在基层医院临床推广。
技术实现思路
[0006]本专利技术是为了提供一种更为便捷、成本更低的肺癌检测手段，采用基于荧光探针PCR的方法，通过检测两个肺癌相关基因血浆中ctDNA甲基化位点，可以有效判断早期肺癌发生情况。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供的技术方案如下：
[0008]经专利技术人研究发现，通过检测ALX3基因和HOXC13基因中两种基因的甲基化水平，来诊断肺癌的灵敏度和特异性好，利于肺癌的早期诊断。ALX3基因和HOXC13基因为hg38人类基因组中的基因。
[0009]一种检测肺癌DNA甲基化生物标记物的引物组合物在制备肺癌检测产品中的应用，甲基化生物标记物包括人类基因组中ALX3基因Chr1:110068116
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110068395之间的CpG和HOXC13基因Chr12:53927558
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53927842之间的CpG。引物组合物为针对ALX3基因
[0010]Chr1:110068116
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110068395之间的区域设计的甲基化位点引物对和探针，以及针
对HOXC13基因Chr12:53927558
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53927842之间的区域设计的甲基化位点引物对和探针。
[0011]具体一种引物组合物为：ALX3基因的甲基化位点引物对的核苷酸序列为：SEQ ID No:1(TGGGGCGTAGTTGCGC)、SEQ ID No:2
[0012](ATAAAAAATAACGAACGAAAAAAAAACCCG)，探针的核苷酸序列为SEQ ID No:5(CGGGAAATAAGGCGGGTTTTTTTTTCGTTCGTT)；HOXC13基因的甲基化位点引物对的核苷酸序列为：SEQ ID No:3(ATAGTGGCGGGAAACGAGC)、SEQ ID No:4(CCAAAACAACGAACGAACGAACG)，探针的核苷酸序列为SEQ ID No:6(TTAGTTGGTCGGGTCGCGTTTTTTAGTTATCGTT)。其中，ALX3探针的5'端标记有报告荧光基团FAM，3'端标记有淬灭荧光基团BHQ；HOXC13探针的5'端标记有报告荧光基团HEX，3'端标记有淬灭荧光基团BHQ。
[0013]前述肺癌检测产品包括试剂盒或单独试剂。
[0014]一种用于肺癌检测试剂盒，该试剂盒用于检测血浆ctDNA中Chr1:110068116
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110068395之间的CpG和Chr12:53927558
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53927842之间的CpG的甲基化程度。该试剂盒含有前述的特异性扩增引物组合物。
[0015]试剂盒包括上述的DNA甲基化生物标记物，包括用于检测上述的肺癌的生物标志物的甲基化水平的试剂，以及还包括上述甲基化生物标记物的引物组合物。
[0016]该试剂盒采用甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化荧光法、甲基化特异性高效液相层析法或数字PCR法检测ALX3基因和HOXC13基因两种基因的甲基化水平。
[0017]上述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。核酸提取试剂用于提取核酸；甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；质控试剂用于质控；PCR反应试剂用于构建PCR扩增反应体系；核酸测序试剂用于测序。甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂。质控试剂包括阳性参考品和阴性参考品。可选地，阳性参考品采用人甲基化基因组DNA，阴性参考品采用人非甲基化基因组DNA。
[0018]PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和TaqDNA聚合酶。
[0019]循环肿瘤DNA(ctDNA)是肿瘤患者血液中游离的来自肿瘤细胞的DNA，肿瘤细胞坏死或者凋亡后，细胞中的DNA释放进入循环系统，游离地存在于血液当中。通过检测ctDNA的相关基因甲基化状态，可以获知体内肿瘤组织信息，从而为肿瘤诊断提供依据。血浆中的游离DNA能用作检测肿瘤，具有对病人伤害小，特异性好等特点。但是由于其在血浆中的含量极低，因此，存在灵敏度较低的问题。使用上述的检测试剂，能够使用血浆中的游离DNA作为样本进行检测，具有较高的灵敏度和准确性。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0021]本专利技术通过研究血浆ctDNA特定CpG位点上的DNA甲基化修饰在肺癌患者疾病的人群中的甲基化差异，得知DNA甲基化标记物能够作为肺癌诊断标记物。本专利技术通过检测两个与肺癌相关的特异性甲基化标志物，灵敏度高，特异性好，能够显著提高肺癌的检出率，相较NGS检测，大幅减低检测成本。并鉴于血浆检测的无创性，适于大规模推广应用。
附图说明
[0022]图1是TCGA数据库中肺癌组织和肺正常组织ALX3基因cg18786873位点的对比图。
[0023]图2是TCGA数据库中肺癌组织和肺正常组织HOXC13基因cg07915921本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测肺癌DNA甲基化生物标记物的引物组合物在制备肺癌检测产品中的应用，其特征在于，所述甲基化生物标记物包括人类基因组中ALX3基因Chr1:110068116
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110068395之间的CpG和HOXC13基因Chr12:53927558
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53927842之间的CpG；所述引物组合物为针对ALX3基因Chr1:110068116
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110068395之间的区域设计的甲基化位点引物对和探针，以及针对HOXC13基因Chr12:53927558
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53927842之间的区域设计的甲基化位点引物对和探针。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，引物组合物为：ALX3基因的甲基化位点引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：马辰凯，王燕虹，李进，
申请(专利权)人：苏州朗希康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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