基于CpG寡核苷酸串联分子的对虾免疫增强剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种基于CpG寡核苷酸串联分子的对虾免疫增强剂及其应用。本发明专利技术提供了8种CpG ODNs串联分子，研究结果表明它们在改善对虾肠道菌群结构的同时，显著上调对虾肝胰腺和肠道免疫基因表达，以及增强对虾肝胰腺和肠道抗氧化酶活性，从而增强对虾免疫力。该产品的开发对于降低对虾养殖过程中的病害率，提高经济效益，推动对虾养殖业的发展有重要意义。推动对虾养殖业的发展有重要意义。推动对虾养殖业的发展有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
基于CpG寡核苷酸串联分子的对虾免疫增强剂及其应用


[0001]本专利技术属于水产养殖
，特别涉及基于CpG寡核苷酸串联分子的对虾免疫增强剂及其应用。

技术介绍

[0002]凡纳滨对虾（Penaeus vannamei），又名南美白对虾，由于生长周期短、营养价值高、便于运输等优势，已经成为对虾养殖业中利润最高的品种之一。随着对虾养殖业在世界范围内的迅速发展，高密度、集约化的养殖模式增加了水体生态环境负担，不仅导致养殖环境严重恶化、苗种质量不断退化、养殖产量急剧下降，而且造成对虾机体抗逆性及抗病性下降，由细菌、病毒以及毒素引起的疫病频繁暴发。例如，由副溶血弧菌引起的对虾急性肝胰腺坏死病或早期死亡综合症，由桃拉病毒引起的对虾桃拉病，由黄头病毒引起的黄头病以及由微孢子虫引起的对虾肝肠孢虫病等，各种防治手段束手无策，养殖对虾产量持续下降，严重制约着对虾养殖业的健康可持续发展。因此，如何利用现代生物学技术，研究对虾免疫调控的分子机理，开发新型对虾抗病制剂，采取有效策略提高对虾自身的免疫力和抵抗力，对于提高对虾养殖经济收益，推动对虾养殖业的发展有重要意义。
[0003]传统上治疗和预防对虾各类疫病主要依赖使用抗生素和化学类药物等，然而药物的滥用又造成养殖水体中药物残留、耐药性病原微生物产生以及环境污染等严重问题，阻碍了对虾养殖业的健康发展。免疫增强剂是一类能够激活机体免疫力的物质，以其广谱、高效、环保等优点，在水产动物疫病防治中得到了广泛的关注和应用。对虾免疫增强剂主要是通过提高对虾非特异免疫能力，增强其抗病性，根据其成分可分为人工合成制剂、动植物制剂、微生物制剂及其衍生物和营养因子物质等。其中，CpG oligodeoxynucleotides（CpG ODNs）为含有未甲基化的CG基序寡核苷酸单链，均能够有效的激活并调控机体的先天免疫系统，属于活性较强的免疫增强剂。CpG ODNs的功能受CpG二核苷酸侧翼序列、ODN骨架及特殊序列影响，它们具有种属特异性、细胞特异性，有的甚至作用完全相反。目前，关于CpG ODNs在作为凡纳滨对虾免疫增强剂方面的相关报道并不多见。因此，开发一种基于CpG ODNs串联分子、针对于凡纳滨对虾的免疫增强制剂，对于降低其养殖过程中的病害率，提高经济效益，推动对虾养殖业的发展有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在提供一种基于CpG 寡核苷酸串联分子的对虾免疫增强剂，该免疫增强剂通过调控对虾肠道菌群结构、上调对虾肝胰腺和肠道免疫基因表达，以及增强对虾肝胰腺和肠道抗氧化酶活性，从而增强对虾免疫力。
[0005]本专利技术技术方案如下：本专利技术的目的之一是提供一种基于CpG 寡核苷酸串联分子的对虾免疫增强剂，包括S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8 CpG ODNs 串联分子中的至少一种，其中，S1 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；S3 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；S4 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；S5 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；S6 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；S7 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；S8 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0006]本专利技术的目的之二是提供所述基于CpG 寡核苷酸串联分子的对虾免疫增强剂的制备方法，该方法包括以下步骤：（1）将合成的CpG ODNs串联分子克隆到pUC57质粒上并进行扩增；（2）用鸡蛋清将CpG ODNs串联分子包裹，添加到对虾饲料原料中充分搅拌均匀，制成对虾饲料。
[0007]优选的，所述CpG ODNs串联分子在饲料中的含量为30~60 mg/kg，所述鸡蛋清在饲料中的含量为3~6 mg/kg且被证明不会影响使用效果。
[0008]更优选的，所述CpG ODNs串联分子在饲料中的含量为50 mg/kg，所述鸡蛋清在饲料中的含量为5 mg/kg。
[0009]进一步的，本专利技术的目的之三是提供所述基于CpG 寡核苷酸串联分子的对虾免疫增强剂的应用，所述应用包括：在制备用于改善对虾肠道菌群结构的产品中的应用。
[0010]肠道是对虾消化吸收和营养代谢的主要器官，同时也是机体抵御病原入侵的第一道防线，肠道内栖居的菌群与肠道黏膜结合和黏附，形成具有一定规律的膜菌群，与宿主的微空间结构组成的相互依赖、相互作用的微生态系统。肠道菌群在调节肠道有益菌和有害菌的比例、调节机体免疫以及营养消化和吸收等方面发挥着重要作用。
[0011]本专利技术将制备的含有50 mg/kg CpG ODNs串联分子的饲料喂养对虾，饲喂过程持续14天，每天饲喂3次，根据本专利技术的实施例，饲喂量为对虾体重的5%
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8%。收集饲喂第0、7和14天的对虾完整肠道，通过对肠道菌群进行16S rDNA测序，发现饲喂后对虾肠道菌群结构发生显著变化，物种丰富度显著增加，致病菌如弧菌相对丰度明显降低。对不同肠道菌群进行功能注释发现，与免疫相关的通路如抗原加工呈递途径得到加强。说明CpG ODNs串联分子能够通过饲喂的方式进入凡纳滨对虾体内，显著改善对虾肠道菌群结构，调节肠道有益菌和有害菌的比例，进而增强对虾免疫力，从而可进一步开发作为一种新型对虾免疫增强剂，应用于对虾养殖产业中，增强对虾抗病能力，提高对虾养殖产量。
[0012]本专利技术的目的之四是提供所述基于CpG 寡核苷酸串联分子在制备用于改善对虾免疫力和抗氧化活性的产品中的应用。
[0013]优选的，所述对虾为凡纳滨对虾。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益成果在于：1.本专利技术提供了一种对虾免疫增强剂，其通过CpG ODNs串联分子改善对虾肠道菌群结构，增强其免疫力。
[0015]2.本专利技术提供了一种将CpG ODNs串联分子添加到对虾饲料中的方法，具体为将CpG ODNs串联分子用少量鸡蛋清包裹后，添加到对虾饲料原料中混匀进行制备。
[0016]3.本专利技术中的对虾免疫增强剂被对虾取食后，随着饲料的被消化，CpG ODNs串联
分子被肠道吸收，并随着对虾的开放式循环系统运输至其它组织器官，在改善对虾肠道菌群结构的同时，显著上调对虾肝胰腺和肠道免疫基因表达，以及增强对虾肝胰腺和肠道抗氧化酶活性，从而增强对虾免疫力。
附图说明
[0017]图1
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图4：饲喂CpG ODNs串联分子后对虾肝胰腺和肠道免疫相关基因表达量变化情况。图1：第7天肝胰腺；图2：第7天肠道；图3：第14天肝胰腺；图4： 第14天肠道。
[0018]图5
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图6：饲喂CpG ODNs串联分子后对虾肝胰腺和肠道抗氧化酶活性变化情况。图5：第14天肝胰腺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CpG 寡核苷酸串联分子的对虾免疫增强剂，包括S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8 CpG ODNs 串联分子中的至少一种，其特征在于，S1 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；S2 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；S3 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；S4 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；S5 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；S6 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；S7 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；S8 CpG ODNs 串联分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。2.权利要求1所述基于CpG 寡核苷酸串联分子的对虾免疫增强剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王孟强，胡峰，巩学蕊，胡景杰，包振民，
申请(专利权)人：中国海洋大学三亚海洋研究院，
类型：发明
国别省市：