一种细胞外囊泡的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞外囊泡的鉴定方法，涉及细胞外囊泡的鉴定技术领域。该方法依次包括以下步骤：将多聚赖氨酸溶液滴在玻片上，进行包被，风干，然后滴加细胞外囊泡溶液，室温孵育，然后滴加荧光素

【技术实现步骤摘要】
一种细胞外囊泡的鉴定方法


[0001]本专利技术涉及细胞外囊泡的鉴定
，具体涉及一种细胞外囊泡的鉴定方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到10000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡(Microvesicles，MVs)和外泌体(Exosomes，Exos)组成，微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为150nm
‑
10000nm；外泌体由细胞内的多泡小体(multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为30nm
‑
150nm。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现细胞外囊泡水平的升高，它们很有可能成为这类疾病的诊断标志物，因此，对细胞外囊泡进行准确的分离与鉴定显得尤为重要。
[0003]目前，细胞外囊泡(EVs)鉴定方法主要有透射电子显微镜、流式细胞术、酶联免疫吸附分析、蛋白质印迹、动态光散射技术和纳米颗粒跟踪分析技术，上述方法存在操作复杂、重复性不佳以及不适合检测生物液体中的标志蛋白等缺点。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种细胞外囊泡的鉴定方法，以解决现有鉴定方法操作复杂、重复性不佳的问题。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种细胞外囊泡的鉴定方法，依次包括以下步骤：
[0006](1)将多聚赖氨酸溶液滴在玻片上，进行包被30
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50min，风干，然后滴加细胞外囊泡溶液，室温孵育25
‑
35min；
[0007](2)滴加荧光素
‑5‑
马来酰亚胺溶液，室温避光孵育25
‑
35min，然后在共聚焦显微镜下进行荧光鉴定。
[0008]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进：
[0009]进一步，步骤(1)中，多聚赖氨酸溶液的浓度为90
‑
110μg/mL。
[0010]进一步，步骤(1)中，多聚赖氨酸溶液的浓度为100μg/mL。
[0011]进一步，步骤(1)中，细胞外囊泡溶液的浓度为0.8
‑
1.2μg/μL。
[0012]进一步，步骤(1)中，细胞外囊泡溶液的浓度为1μg/μL。
[0013]进一步，步骤(2)中，荧光素
‑5‑
马来酰亚胺溶液的浓度为1.8
‑
2.2μmol/L。
[0014]进一步，步骤(2)中，荧光素
‑5‑
马来酰亚胺溶液的浓度为2μmol/L。
[0015]进一步，步骤(1)
‑
(2)中，多聚赖氨酸溶液、细胞外囊泡溶液和荧光素
‑5‑
马来酰亚胺溶液的体积比为1：1：0.8
‑
1.2。
[0016]进一步，步骤(1)
‑
(2)中，多聚赖氨酸溶液、细胞外囊泡溶液和荧光素
‑5‑
马来酰亚胺溶液的体积比为1：1：1。
[0017]本专利技术还提供上述方法在细胞外囊泡的鉴定方面的应用。
[0018]本专利技术具有以下有益效果：
[0019]本专利技术实现胞外囊泡的粘附、荧光标记，发展了胞外囊泡标志物的特异性标记技术，利用共聚焦显微镜可以精确观察胞外囊泡及其标记物，可以在3h以内完成检测，实现了对囊泡的快检。
附图说明
[0020]图1为细胞外囊泡与F5M和CD63共同标记的操作流程图；
[0021]图2为细胞外囊泡傅里叶红外光谱；
[0022]图3为胞外囊泡与CD63结合荧光图；
[0023]图4为胞外囊泡与F5M结合荧光图；
[0024]图5为胞外囊泡F5M和CD63结合荧光图。
具体实施方式
[0025]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0026]实施例1：
[0027]一种细胞外囊泡的鉴定方法，依次包括以下步骤：
[0028]将100μL浓度为100μg/mL多聚赖氨酸(PLL)溶液滴在玻片上，进行包被40min，风干，使PLL与玻片交联，以便之后粘附胞外囊泡，然后滴加100μL步骤(1)得到的细胞外囊泡溶液(浓度为1μg/μL)，室温孵育30min，使胞外囊泡与PLL交联，然后滴加100μL荧光素
‑5‑
马来酰亚胺溶液(浓度为2μmol/L)，室温避光孵育30min，使F5M与胞外囊泡结合，再在共聚焦显微镜下进行荧光鉴定。(见图1中前3步)
[0029]实施例2：
[0030]一种细胞外囊泡的鉴定方法，依次包括以下步骤：
[0031]将100μL浓度为90μg/mL多聚赖氨酸(PLL)溶液滴在玻片上，进行包被30min，风干，使PLL与玻片交联，以便之后粘附胞外囊泡，然后滴加100μL步骤(1)得到的细胞外囊泡溶液(浓度为0.8μg/μL)，室温孵育25min，使胞外囊泡与PLL交联，然后滴加80μL荧光素
‑5‑
马来酰亚胺溶液(浓度为1.8μmol/L)，室温避光孵育25min，使F5M与胞外囊泡结合，再在共聚焦显微镜下进行荧光鉴定。
[0032]实施例3：
[0033]一种细胞外囊泡的鉴定方法，依次包括以下步骤：
[0034]将100μL浓度为110μg/mL多聚赖氨酸(PLL)溶液滴在玻片上，进行包被50min，风干，使PLL与玻片交联，以便之后粘附胞外囊泡，然后滴加100μL步骤(1)得到的细胞外囊泡溶液(浓度为1.2μg/μL)，室温孵育35min，使胞外囊泡与PLL交联，然后滴加120μL荧光素
‑5‑
马来酰亚胺溶液(浓度为2.2μmol/L)，室温避光孵育35min，使F5M与胞外囊泡结合，再在共
聚焦显微镜下进行荧光鉴定。
[0035]试验例
[0036]一、囊泡标记
‑
红外检测
[0037](1)进行连接反应，各组试剂加量如下：总体积90μL
[0038][0039]胞外囊泡浓度为3mg/mL，F5M储存液浓度为3μmol/L，终浓度为2μmol/L。
[0040](2)按上表进行反应，反应时将悬液涡旋震荡均匀。将悬液在室温下避光摇动孵育30min。
[004本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞外囊泡的鉴定方法，其特征在于，依次包括以下步骤：(1)将多聚赖氨酸溶液滴在玻片上，进行包被30
‑
50min，风干，然后滴加细胞外囊泡溶液，室温孵育25
‑
35min；(2)滴加荧光素
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马来酰亚胺溶液，室温避光孵育25
‑
35min，然后在共聚焦显微镜下进行荧光鉴定。2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，多聚赖氨酸溶液的浓度为90
‑
110μg/mL。3.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，多聚赖氨酸溶液的浓度为100μg/mL。4.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，细胞外囊泡溶液的浓度为0.8
‑
1.2μg/μL。5.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，细胞外囊泡溶液的浓度为1μg/μL。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾烨，沈钧怡，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：