apoea基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种apoea基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，将人工合成的SgRNA片段和商业化的Cas9蛋白混合后，通过显微注射将混合液注射到1细胞期的斑马鱼受精卵中，受精卵培养后孵化，即得；SgRNA片段具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。据此，还建立了一种动脉粥样硬化或高脂血症动物模型。相比传统方法，本发明专利技术具有如下显著优势(1)实验周期短；(2)过程简单方便，且基因编辑成功率高；(3)建模时间短，效果稳定的特点。因此，本发明专利技术可缩短高脂血症及动脉粥样硬化发病进程、加深发病程度，造模时间短，在幼鱼期实现疾病造模，有利于实验过程中的活体实施观察，可成为斑马鱼高脂血症及动脉粥样硬化疾病良好的动物模型。血症及动脉粥样硬化疾病良好的动物模型。

【技术实现步骤摘要】
apoea基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因编辑
，尤其涉及一种apoea基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]心血管疾病已经成为威胁人类健康的首要因素，动脉粥样硬化是心血管疾病的最主要也是最关键的疾病类型，这种病与其他形式的心血管病有关，如冠状动脉疾病、缺血性中风、高血压和外周动脉疾病，动脉粥样硬化斑块的破裂导致血栓形成是引发心脑血管死亡的重要原因之一。动脉粥样硬化发病机制复杂，其机制研究目前研究仍不充分，另外目前临床上用于动脉粥样硬化的治疗策略和手段仍比较有限，主要是通过降低血脂来实现的，针对关键发病机制的研究以及靶点药物研发扔需要更多的研究和验证。
[0003]动物疾病模型是现代医学研究的重要工具。最初的动脉粥样硬化动物模型是通过高胆固醇饮食诱导获得的，包括小鼠、兔子、猪和非人类灵长类动物等物种。目前大量的动脉粥样硬化研究依赖于小鼠疾病模型，主要为ApoE基因敲除小鼠以及LDL受体LDLr基因敲除小鼠。特别是ApoE基因敲除小鼠，因其可在正常饮食条件下会自发的形成动脉粥样硬化而应用更为广泛。尽管目前各种动物模型在动脉粥样硬化的研究中发挥了重要的作用，但是也具有其局限性：自然高胆固醇血症诱导产生的动物模型建立模型时间长且个体差异太大不利于研究；而基因敲除小鼠模型中LDLr
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需要通过高脂饮食来进一步诱导促进动脉粥样硬化的发生，模型建立周期长；ApoE
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小鼠虽然自然饮食条件下可自发形成动脉粥样硬化，且高脂饮食喂养后促进模型的建立，但是小鼠不能够实时观察动脉斑块的形成，需要通过解剖后才能观察血管中斑块的情况，使用成本高、实验周期长且不能实时观察是小鼠模型的限制因素。
[0004]斑马鱼具有生长周期短，实验成本低，且幼鱼阶段都是光学透明这使得在活体中能够对荧光蛋白和探针进行实时的观察。同时在斑马鱼中能够重现许多与早期动脉粥样硬化形成有关的过程，例如血管脂质积累和内皮细胞层的紊乱和增厚等，另外斑马鱼中脂类的运输和代谢与小鼠和人中相似。因此，斑马鱼也是研究高血脂相关疾病尤其是动脉粥样硬化的很好的模式动物。目前斑马鱼中的动脉粥样硬化模型有报道的主要还是通过高胆固醇饮食诱导非转基因或者基因敲除LDLr斑马鱼建立的。这两种模型实验周期长、模型建立繁琐且成年后的斑马鱼身体透明程度下降，影响荧光观察。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简单、效果良好的apoea基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及其应用，该法所得动物模型为高脂血症及动脉粥样硬化疾病的研究提供了技术保障。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]apoea基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，将人工合成的SgRNA片段和商业化的
Cas9蛋白混合后，通过显微注射将混合液注射到1细胞期的斑马鱼受精卵中，受精卵培养后孵化，即得；SgRNA片段具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。
[0008]SgRNA片段是采用一对基因编辑的靶位点序列，加入SgRNA骨架，利用RNA序列体外合成；靶位点序列为SgRNAEa1和SgRNAEa2，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的碱基序列。
[0009]SgRNA片段和Cas9蛋白按1:1摩尔比例混合。
[0010]注射按1nL混合液/卵注射至受精卵的动物极中，注射在产卵后1h内完成。
[0011]上述方法得到的apoea基因缺失斑马鱼突变体在构建动物模型中的应用。
[0012]动物模型为动脉粥样硬化或高脂血症动物模型。
[0013]动脉粥样硬化动物模型的构建方法，采用上述方法得到的apoea基因缺失斑马鱼突变体，通过喂养高脂饲料而得。
[0014]高脂饲料为正常斑马鱼饲料中额外加入24％脂肪和4％胆固醇制成。
[0015]喂养采用5dpf(受精后5天)斑马鱼，每天喂养高脂饲料两次，连续喂养5
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7天。
[0016]ApoE蛋白在斑马鱼中同源区域与人类保守性好，且在斑马鱼脂类运输和代谢中具有非常重要的作用。专利技术人利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，建立了一种apoea基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，将人工合成的SgRNA片段和商业化的Cas9蛋白混合后，通过显微注射将混合液注射到1细胞期的斑马鱼受精卵中，受精卵培养后孵化，即得；SgRNA片段具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。研究表明，apoea基因缺失斑马鱼突变体在自然饮食条件下自发诱导动脉粥样硬化，且高胆固醇饮食条件下诱发速度缩短、发病程度加深。据此，专利技术人还建立了一种动脉粥样硬化或高脂血症动物模型。相比于传统的需要制备SgRNA和Cas9基因mRNA来完成的CRISPR/Cas9基因编辑技术，本专利技术直接使用人工合成的SgRNA片段和商业化的Cas9蛋白构建基因编辑斑马鱼，具有如下显著优势：
[0017](1)实验周期短：省去了制备SgRNA和Cas9 mRNA的时间(大约2周)。
[0018](2)过程简单方便，且基因编辑成功率高：人工合成SgRNA片段并购买商业化的Cas9蛋白后，按照本专利技术优化工艺条件，混合后即可注射受精卵，且结构修饰优化后的SgRNA可以有效防止RNA的降解，直接使用Cas9蛋白也可避免使用Cas9 mRNA因降解导致的失活问题，显著提高基因编辑的成功率，构建的基因敲除斑马鱼可稳定遗传。
[0019](3)利用apoea基因敲除斑马鱼构建动脉粥样硬化模型具有建模时间短，效果稳定的特点：在正常自然饮食条件下敲除apoea基因即可自发形成高血脂，并形成少量的动脉粥样硬化斑块，进一步结合高胆固醇(4％胆固醇)饮食诱导，WT型的AB品系斑马鱼一般需要7
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11天才可形成斑块，而apoea基因敲除斑马鱼在诱导5天后即可显著观察到血管中脂质的堆积和斑块的形成。因此，本专利技术可缩短高脂血症及动脉粥样硬化发病进程、加深发病程度，造模时间短，在幼鱼期实现疾病造模，有利于实验过程中的活体实施观察，可成为斑马鱼高脂血症及动脉粥样硬化疾病良好的动物模型。
附图说明
[0020]图1是SgRNA编辑效果检测结果图。
[0021]图2是apoea基因敲除斑马鱼发育观察图，图中：AB正常斑马鱼，apoeA
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/+apoea基因敲除斑马鱼。
[0022]图3是apoea基因敲除斑马鱼发育异常情况统计图。
[0023]图4是F2代斑马鱼基因编辑区域PCR片段DNA电泳图，图中：泳道1为WT(AB)，泳道2
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11分别为10个apoea基因编辑斑马鱼样品，编号依次为Ea
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1、Ea
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2、Ea
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3、Ea
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4、Ea
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5、Ea
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种apoea基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于：将人工合成的SgRNA片段和商业化的Cas9蛋白混合后，通过显微注射将混合液注射到1细胞期的斑马鱼受精卵中，受精卵培养后孵化，即得；所述SgRNA片段具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述SgRNA片段是采用一对基因编辑的靶位点序列，加入SgRNA骨架，利用RNA序列体外合成；所述靶位点序列为SgRNAEa1和SgRNAEa2，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的碱基序列。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述SgRNA片段和Cas9蛋白按1:1摩尔比例混合。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张帆，郝二伟，邓家刚，侯小涛，杜正彩，夏中尚，谢金玲，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：