PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术提出一种PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用，属于抗肿瘤细胞技术领域，能够解决现有的增强型NK细胞治疗杀伤活性不显著、安全性不足、存在致瘤性潜在风险的同时，还需加入外源IL

【技术实现步骤摘要】
PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于抗肿瘤细胞
，尤其涉及一种PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，参与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节等一系列的机体免疫活动。NK的细胞来源有很多种，如外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)、脐带血单个核细胞(Umbilical Cord Blood Mononuclear Cell，UCBMC)、NK细胞系(NK
‑
92等)和诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells，iPSC)等。其中，PBMC来源的NK细胞相较于其他几种具有明显优势，主要体现在：(1)外周血来源广泛可靠，除了使用患者自己的PBMC细胞外，使用亲属或其他人的PBMC的NK被用于回输和治疗均无GvHD和免疫抑制；(2)PBMC来源的NK细胞属于原代细胞，不存在致瘤性的潜在风险等，具有较高的安全性；(3)相较于其他几种来源，PBMC来源的NK细胞高表达CD16和NKG2D，杀伤活性强。因此，采用CAR修饰外周血来源的NK细胞(PBMC
‑
NK细胞)能够增强靶向杀伤肿瘤细胞能力。但是，临床研究发现异体回输后NK细胞在体内的存活周期相对较短，另外在缺乏细胞因子刺激的情况下NK细胞的杀伤功能也受到限制。
[0003]基于上述问题，研究表明，白介素
‑
12(IL
‑
12)能够激活NK细胞，促进其增殖并分泌肿瘤杀伤因子(如IFN
‑
γ等)对肿瘤细胞进行杀伤，因此工程化PBMC来源的CAR
‑
NK细胞组成性分泌IL
‑
12是安全、高效治疗实体瘤，增强NK持续杀伤效应的良好策略。但现有技术未见相关报道，仅有部分专利(WO2020051363A1)公开了采用IL
‑
12靶向嵌合蛋白在体内或体外刺激NK细胞，促进NK细胞功能的方法，该方法的局限性在于：(1)IL
‑
12体外刺激后除去IL
‑
12再进行输注治疗，NK细胞的效果并不显著；(2)体内输注刺激时IL
‑
12靶向嵌合蛋白可以依靠靶向作用到达肿瘤部位，但足够数量的NK细胞不一定能到达肿瘤的位置，进而导致治疗效果不显著。
[0004]因此，目前采用IL
‑
12靶向嵌合蛋白刺激NK细胞的方式，其对增强肿瘤治疗效果并不显著，如何研发出一种安全性高、杀伤效果显著、不存在致瘤性潜在风险，且无需加入外源IL
‑
12，从而避免全身注射所引起的副反应的增强型抗肿瘤NK细胞是本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有的增强型NK细胞治疗杀伤活性不显著、安全性不足、存在致瘤性潜在风险的同时，还需加入外源IL
‑
12，对人体产生副反应的技术问题，提出一种PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞，能够同时表达HER2和IL
‑
12，通过HER2靶向肿瘤细胞，并自分泌IL
‑
12增强抗肿瘤能力；
[0008]所述PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞通过将IL
‑
12慢病毒和HER2
‑
CAR慢病毒共同感染PBMC
‑
NK细胞，然后经过检测与鉴定试验制备得到。
[0009]在一实施方式中，所述IL
‑
12慢病毒中包含人工合成的IL
‑
12基因，所述人工合成的IL
‑
12基因是将人的天然IL
‑
12基因的p35亚基基因和p40亚基基因通过连接肽基因连接后得到，所述人工合成的IL
‑
12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0010]所述HER2
‑
CAR慢病毒包含人工合成的HER2
‑
CAR基因，所述人工合成的HER2
‑
CAR基因是将从NCBI数据库获得的人CD8α信号肽基因、靶向HER2单链抗体基因、人CD8α铰链区基因、人CD8α跨膜区基因、4
‑
1BB的胞内区基因以及人CD3ζ胞内信号肽基因序列连接后经密码子优化得到，所述人工合成的HER2
‑
CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]在一实施方式中，PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞的HER2
‑
CAR细胞阳性率在13.2％以上，慢病毒感染72h后培养上清中IL
‑
12和IFN
‑
γ含量分别为99.7ng/ml之上和16.5ng/ml之上。
[0012]本专利技术还提供了一种PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0013]慢病毒表达载体构建：将人工合成的IL
‑
12基因和人工合成的HER2
‑
CAR基因分别连接到慢病毒载体质粒I和慢病毒载体质粒II上，构建得到IL
‑
12慢病毒表达载体和HER2
‑
CAR慢病毒表达载体；
[0014]慢病毒表达载体包装：将所述IL
‑
12慢病毒表达载体和HER2
‑
CAR慢病毒表达载体分别与包装质粒共转染293T细胞，培养一段时间后，再经收集、浓缩处理，得到IL
‑
12慢病毒和HER2
‑
CAR慢病毒；
[0015]PBMC
‑
NK细胞的分离与扩增：取健康人体外周血，采用添加自体血浆的NK诱导培养基进行NK细胞激活、诱导和扩增，获得PBMC
‑
NK细胞；
[0016]PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞构建与鉴定：将所述IL
‑
12慢病毒和HER2
‑
CAR慢病毒按照一定的MOI值共同感染所述PBMC
‑
NK细胞，培养收集细胞，再经细胞阳性率检测、细胞因子分泌检测以及体外杀伤试验鉴定后，最终得到所述PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞。
[0017]在一实施方式中，所述慢病毒载体质粒I和慢病毒载体质粒II选自PGMLV质粒、lenti质粒、pCDH质粒、pLVX质粒或pRRLSIN质粒。
[0018]在一实施方式中，所述IL
‑
12慢病毒的滴度为(1
‑
10)
×
108TU/ml，HER2
‑
CA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，能够同时表达HER2和IL
‑
12，通过HER2靶向肿瘤细胞，并自分泌IL
‑
12增强抗肿瘤能力；所述PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞通过将IL
‑
12慢病毒和HER2
‑
CAR慢病毒共同感染从PBMC中扩增获得的NK细胞，然后经过检测与鉴定试验制备得到。2.根据权利要求1所述的PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，所述IL
‑
12慢病毒中包含人工合成的IL
‑
12基因，所述人工合成的IL
‑
12基因是将人的天然IL
‑
12基因的p35亚基基因和p40亚基基因通过连接肽基因连接后得到，所述人工合成的IL
‑
12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述HER2
‑
CAR慢病毒包含人工合成的HER2
‑
CAR基因，所述人工合成的HER2
‑
CAR基因是将从NCBI数据库获得的人CD8α信号肽基因、靶向HER2单链抗体基因、人CD8α铰链区基因、人CD8α跨膜区基因、4
‑
1BB的胞内区基因以及人CD3ζ胞内信号肽基因序列连接后经密码子优化得到，所述人工合成的HER2
‑
CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，其HER2
‑
CAR细胞阳性率在13.2％以上，慢病毒感染72h后培养上清中IL
‑
12和IFN
‑
γ含量分别为99.7ng/ml之上和16.5ng/ml之上。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的PBMC来源的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：慢病毒表达载体构建：将人工合成的IL
‑
12基因和人工合成的HER2
‑
CAR基因分别连接到慢病毒载体质粒I和慢病毒载体质粒II上，构建得到IL
‑
12慢病毒表达载体和HER2
‑
CAR慢病毒表达载体；慢病毒表达载体包装：将所述IL
‑
12慢病毒表达载体和HER...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩倩，王建刚，胡祥维，王媛媛，吴明远，
申请(专利权)人：康立泰生物医药青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：