一种双功能融合蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种双功能融合蛋白的纯化方法。本发明专利技术的纯化方法采用两步层析纯化IL15/PD

【技术实现步骤摘要】
一种双功能融合蛋白的纯化方法


[0001]本专利技术属于蛋白纯化领域，具体的涉及一种双功能融合蛋白的纯化方法。

技术介绍

[0002]1994年，Grabstein等发现了一种分子量大小为12
‑
14KD的细胞因子，白介素15。白介素15作为T细胞和NK细胞生长因子，在免疫细胞的产生、复制和激活过程中起着重要的作用。美国国家癌症研究中心将白介素15列为癌症免疫治疗中最具有潜力的靶点之一。美国FDA已经批准另一种相关的细胞因子，白介素2，用来治疗肾细胞癌症和恶性黑色素瘤。
[0003]PD
‑
L1，细胞程序性死亡配体1，是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码，分子量大小为40KD。PD
‑
L1一般表达于肿瘤细胞表面。PD
‑
1，细胞程序性死亡受体
‑
1(PD
‑
1)，为CD28超家族成员，表达于T细胞表面。当PD
‑
L1与PD
‑
1连接以后，T细胞就不能够发现肿瘤和向免疫系统发出攻击肿瘤的信号。通过设计PD
‑
L1抗体，可以切断PD
‑
L1与PD
‑
1连接，使肿瘤细胞被免疫细胞识别并杀死肿瘤细胞。
[0004]IL15/PD
‑
L1双功能融合蛋白为申请人自主研发的CHO细胞表达的创新靶点双功能融合蛋白药物。该双功能融合蛋白由IgG1型的抗PD
‑
L1单抗通过其Fc段的C
‑
末端与IL15RαSu及IL
‑
15连接而成，抗PD
‑
L1单抗的每条重链的C
‑
末端均通过G4S连接子(G4S Linker)连接1个IL15RαSu和1个IL
‑
15，IL15RαSu和IL
‑
15之间也是由G4S Linker连接。
[0005]上述IL15/PD
‑
L1双功能融合蛋白通过抗PD
‑
L1抗体与肿瘤细胞表面的PD
‑
L1结合，可解除PD
‑
L1/PD
‑
1介导的免疫检查点抑制效应；同时可以通过激活人原代淋巴细胞表面IL
‑
15受体下游STAT5信号通路，促进T淋巴细胞和NK细胞的功能活性。
[0006]IL15/PD
‑
L1双功能融合蛋白在表达过程中产生了大量的聚体。这些聚体给下游纯化工作带来了巨大的挑战。传统的三步层析，亲和捕获+阴离子流穿+阳离子结合洗脱，对于该抗体已不能达到去除杂质和相关残留标准的目的。由于杂质含量高，会导致整个工艺流程的回收率偏低。

技术实现思路

[0007]为了克服上述缺陷，本专利技术提供了一种两步层析法纯化IL15/PD
‑
L1双功能融合蛋白的纯化方法。
[0008]专利技术详述
[0009]1、术语
[0010]本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入本文。
[0011]在下文详细描述本专利技术前，应理解本专利技术不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本专利技术的范围。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本专利技术所属
领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
[0012]本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本专利技术的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本专利技术的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。
[0013]当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语“约”是指包括指定值的
±
20％、或在某些情况下
±
10％、或在某些情况下
±
5％、或在某些情况下
±
1％、或在某些情况下
±
0.1％的变化。
[0014]本文所用的术语“抗体”，典型是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重(H)多肽链和两条轻(L)多肽链的Y型四聚蛋白。天然IgG抗体即具有这样的结构。每条轻链由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)组成。每条重链包含一个可变结构域(VH)和恒定区。
[0015]如在此使用的，广义上的“抗体”的类型可包括如多克隆抗体(polyclonal antibodies)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体及灵长类化抗体、CDR移植抗体(CDR
‑
grafted antibody)、人类抗体(包括重组产生的人类抗体)、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双功能融合蛋白、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括突变蛋白及其变体)等等。
[0016]术语“单克隆抗体”(或称“单抗”)指由单一细胞克隆产生的基本均质、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物、合成技术或上述技术的组合等。
[0017]术语“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如在此所使用，抗体分子的“片段”包括抗体的“抗原结合片段”，并且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体中与所选抗原或其免疫原性决定部分特异性结合或反应的多肽片段，或由此片段进一步衍生的融合蛋白产物，例如单链抗体，嵌合抗原受体中的胞外结合区等。示例性的抗体片段或其抗原结合片段包括但不限于：可变轻链片段、可变重链片段、Fab片段、F(ab
’
)2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、线性抗体、单链抗体(scFv)及由抗体片段形成的双功能融合蛋白或多特异性抗体等。
[0018]术语“抗原”是指被抗体或抗体结合片段识别并特异性结合的物质，广义上，抗原可以包括所选靶标的任何免疫原性片段或决定簇，包括单表位、多表位、单结构域、多结构域、完整的胞外结构域(ECD)或蛋白质。肽、蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质，其部分及其组合均可构成抗原。非限制性示例性抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原等。“抗原”也可以指引发免疫反应的分子。任何形式的抗原或含有该抗原的细胞或制剂都可以用于生成对抗原决定簇具有特异性的抗体。抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白(例如，用在其表面上表达至少一部分抗原的细胞进行免疫的)、或可溶性蛋白质(例如，仅用该蛋白质的ECD部分进行免疫的)或蛋白质构建体(例如，Fc抗原)。该抗原可以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双功能融合蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：将CHO细胞表达的过滤过的含IL15/PD
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L1双功能融合蛋白的细胞发酵液经过两次层析柱层析，其中第一次层析采用MabSelect SuRe LX亲和层析柱，其中第二次层析采用Capto adhere层析柱。2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将澄清后的含IL15/PD
‑
L1双功能融合蛋白的细胞发酵液过MabSelect SuRe LX亲和层析柱，洗脱，收集含目的抗体蛋白的洗脱峰；(2)步骤(1)中的亲和洗脱峰样品在低pH条件下孵育；(3)步骤(2)中的样品深层过滤；(4)步骤(3)中的样品过Capto adhere层析柱，流穿模式，收集流穿样品；(5)步骤(4)中的样品过纳滤膜；(6)步骤(5)中的样品浓缩置换缓冲液，稀释。3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中分别用淋洗液1和淋洗液2洗涤杂蛋白，再用洗脱液等度洗脱，收集洗脱峰；淋洗1溶液为：50mM Tris
‑
HAC，0.5M Arginine，pH 5.0
±
0.5；淋洗2溶液为：50mM NaAC
‑
HAC，pH 5.0
±
0.5；洗脱溶液为50mM NaAC
‑
HAC，pH 3.9
±
0.3。4.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中亲和洗脱样品用1M HAC调pH至3.6
±
0.2，室温孵育1～4小时结束后用2M Tris调pH至5.0～7.0。5.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用Millipore XOHC膜包对...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈春磊，温云平，陈曦，方言，刘骏，
申请(专利权)人：上海齐鲁制药研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：